Spalthefe als Plattform für antibakterielle Wirkstoffscreenings, die auf bakterielle Zytoskelettproteine abzielen

Summary

Spalthefe wird hier als heterologer Wirt verwendet, um bakterielle Zytoskelettproteine wie FtsZ und MreB als translationale Fusionsproteine mit GFP zu exprimieren, um deren Polymerisation sichtbar zu machen. Auch Verbindungen, die die Polymerisation beeinflussen, werden durch Bildgebung mit einem Fluoreszenzmikroskop identifiziert.

Abstract

Bakterielle Proteine des Zytoskeletts wie FtsZ und MreB erfüllen wesentliche Funktionen wie die Zellteilung und die Aufrechterhaltung der Zellform. Darüber hinaus haben sich FtsZ und MreB als wichtige Ziele für die Entdeckung neuartiger antimikrobieller Wirkstoffe herausgestellt. Es wurden mehrere Assays entwickelt, um Verbindungen zu identifizieren, die auf die Nukleotidbindung und Polymerisation dieser Zytoskelettproteine abzielen, die sich hauptsächlich auf FtsZ konzentrieren. Darüber hinaus sind viele der Assays entweder aufwendig oder kostenintensiv, und um festzustellen, ob diese Proteine das zelluläre Ziel des Medikaments sind, sind oft mehrere Methoden erforderlich. Schließlich stellt auch die Toxizität der Medikamente für eukaryotische Zellen ein Problem dar. Hier beschreiben wir einen einstufigen zellbasierten Assay, um neuartige Moleküle zu entdecken, die auf das bakterielle Zytoskelett abzielen, und um Treffer zu minimieren, die für eukaryotische Zellen potenziell toxisch sein könnten. Spalthefe ist für Hochdurchsatz-Screenings auf der Grundlage der Mikroskopie zugänglich, und ein visueller Screen kann jedes Molekül, das die Polymerisation von FtsZ oder MreB verändert, leicht identifizieren. Unser Assay verwendet die Standard-96-Well-Platte und stützt sich auf die Fähigkeit der bakteriellen Zytoskelettproteine, in einer eukaryotischen Zelle, wie z. B. der Spalthefe, zu polymerisieren. Während die hier beschriebenen Protokolle für Spalthefe gelten und FtsZ aus Staphylococcus aureus und MreB aus Escherichia coli verwenden, sind sie leicht an andere bakterielle Zytoskelettproteine anpassbar, die sich in allen eukaryotischen Expressionswirten leicht zu Polymeren zusammensetzen. Die hier beschriebene Methode sollte dazu beitragen, die weitere Entdeckung neuartiger antimikrobieller Wirkstoffe zu erleichtern, die auf bakterielle Zytoskelettproteine abzielen.

Introduction

Die weit verbreitete Resistenz gegen fast alle Antibiotika, die derzeit zur Bekämpfung bakterieller Infektionen eingesetzt werden, hat einen unmittelbaren Bedarf an neuen Kategorien von Antibiotika geschaffen. Ein Bericht aus dem Jahr 2019 zeigte, dass antibiotikaresistente Infektionen zum Verlust von 1,27 Millionen Menschenleben führten, was zu einer Gesamtzahl von 4,95 Millionen Todesfällen beitrug, wenn man die Komplikationen durch resistente bakterielle Infektionen berücksichtigte¹. Während das derzeitige Arsenal an Antibiotika in der klinischen Praxis immer noch wirksam ist, zielt es hauptsächlich auf ein schmales Spektrum zellulärer Prozesse ab, die sich hauptsächlich auf die Zellwand-, DNA- und Proteinsynthese konzentrieren. In den letzten 50 Jahren wurden weniger als 30 Proteine kommerziell als Ziele für die Entwicklung neuer antibakterieller Wirkstoffe genutzt ^2,3. Diese begrenzte Auswahl an praktikablen Zielen schränkt die Entdeckung neuer Antibiotika oder ihrer Derivate zur Bekämpfung antibiotikaresistenter Bakterien erheblich ein. Um das sich abzeichnende Problem der Antibiotikaresistenz zu überwinden, besteht daher die Notwendigkeit der Entwicklung neuer Antibiotika mit neuartigen Zielen und Wirkmechanismen.

Ein antibakterielles Ziel sollte idealerweise ein wesentlicher Bestandteil des bakteriellen Zellwachstums sein, in allen phylogenetisch vielfältigen Spezies konserviert sein, die geringste eukaryotische Homologie aufweisen und für Antibiotika zugänglich sein⁴. Seit der Entdeckung bakterieller Zytoskelettproteine, die an der Zellteilung und der Aufrechterhaltung der Zellform beteiligt sind, haben sie sich zu einem vielversprechenden Schwerpunkt für die Entwicklung antibakterieller Wirkstoffe entwickelt⁵. Diese Proteine sind essentiell für die Lebensfähigkeit von Bakterien und spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Zellform (MreB, CreS), der Teilung (FtsZ, FtsA) und der DNA-Segregation (ParM, TubZ, PhuZ, AlfA), ähnlich dem Zytoskelett in eukaryotischen Zellen. Bemerkenswert ist, dass FtsZ ein bemerkenswert hohes Maß an Konservierung bei einer Vielzahl von prokaryotischen Organismen aufweist, während MreB in fast allen stäbchenförmigen Bakterien vorkommt. Diese weite Verbreitung und Relevanz für die Lebensfähigkeit von Zellen machen diese Proteine zu einem faszinierenden Ziel in der Antibiotikaforschung ^5,6,7.

Es ist von entscheidender Bedeutung, einen mehrgleisigen Ansatz zu verfolgen, der In-vivo-Beobachtungen, In-vitro-Interaktionen und enzymatische Experimente kombiniert, um bakterielle Zytoskelettproteine als primäres Ziel eines potenziellen Inhibitors gründlich zu validieren⁷. Aufwändige Verfahren oder erhebliche Kostenauswirkungen belasten viele verfügbare Assays für diesen Zweck. Dies sind bemerkenswerte Hindernisse für ihre weit verbreitete Verwendung beim Screening von Leitverbindungen, die das bakterielle Zytoskelett beeinträchtigen könnten. Unter diesen sticht die Mikroskopie als eine außergewöhnlich effiziente und schnelle Methode zur Beurteilung der Wirksamkeit von Verbindungen hervor, indem Veränderungen in der Zellmorphologie direkt untersucht werden. Die Heteroassoziation des Zielproteins mit anderen Zytoskelettkomplexen, indirekte Effekte aufgrund von Off-Target-Bindung und Veränderungen des Membranpotentials, Schwierigkeiten bei der effizienten Durchdringung der Zelle und das Vorhandensein von Effluxpumpen, insbesondere in gramnegativen Bakterien, machen es jedoch komplex, die genaue Ursache der bakteriellen Zelldeformation zu bestimmen ^8,9,10.

Schizosaccharomyces pombe, oder Spalthefe, wie sie allgemein genannt wird, ist ein stäbchenförmiger, einzelliger eukaryotischer Organismus. Die Spalthefe wird aufgrund der außergewöhnlichen Konservierung zellulärer Prozesse wie dem Zellzyklus und der Zellteilung, der zellulären Organisation und der Chromosomenreplikation mit höheren Eukaryoten, einschließlich des Menschen, häufig als Modellorganismus in der Zell- und Molekularbiologie verwendet^11,12. Darüber hinaus exprimierten Errington und Kollegen ein pollokalisiertes bakterielles Zytoskelettprotein DivIVA in Spalthefe, um zu zeigen, dass sich DivIVA auf negativ gekrümmten Oberflächen ansammelte¹³. Auch hier hatten Balasubramanian und seine Gruppe zunächst die Spalthefe als zelluläres Modellsystem etabliert, um neue Einblicke in den Mechanismus, die Assemblierung und die Dynamik des Aktin-Zytoskelett-Proteins von E. coli wie MreB¹⁴ und dem Tubulin-Homolog FtsZ¹⁵ zu gewinnen. Sie zeigen auch die Fähigkeit von A22, die Polymerisation von MreB durch Epifluoreszenzmikroskopie effizient zu behindern, wenn es in Hefe^{exprimiert wird 14}. Im Anschluss daran haben auch andere Gruppen erfolgreich Spalthefe eingesetzt, um die Assemblierungseigenschaften der Chloroplasten FtsZ1 und FtsZ2 Proteine zu untersuchen¹⁶. In jüngerer Zeit haben wir einen Proof-of-Concept für die Machbarkeit der Verwendung von Spalthefe als zelluläre Plattform für das spezifische Screening auf bakterielle Zytoskelett-Inhibitoren erstellt, indem wir eine umfassende Bewertung der Auswirkungen von drei bekannten FtsZ-Inhibitoren – Sanguinarin, Berberin und PC190723-on-FtsZ-Proteine – durchgeführt haben, die von zwei pathogenen Bakterien, nämlich Staphylococcus aureus und Helicobacter pylori¹⁷. Darüber hinaus erweist sich dieser einstufige zellbasierte Assay als entscheidend für die Minimierung des Risikos bei der Identifizierung von Verbindungen, die für eukaryotische Zellen potenziell toxisch sein können.

In diesem Bericht schlagen wir unter Verwendung des Spalthefesystems einen systematischen Arbeitsablauf vor, der die Standard-96-Well-Platte für das halbautomatische Screening und die Quantifizierung der Wirkung von niedermolekularen Inhibitoren verwendet, die auf FtsZ aus Staphylococcus aureus und MreB aus Escherichia coli abzielen. Hier haben wir den teilautomatisierten Workflow mit den etablierten Inhibitoren PC190723 und A22 aufgebaut und optimiert, die spezifisch auf FtsZ bzw. MreB abzielen. Bei diesem Arbeitsablauf wird ein Epifluoreszenzmikroskop verwendet, das mit einem motorisierten, hochpräzisen Tisch und einer automatisierten Bildaufnahme in einer Standard-96-Well-Platte ausgestattet ist, um die derzeitige Standardisierung zu verbessern. Daher kann es sowohl auf Mittel- als auch auf Hochdurchsatz-Screenings von synthetischen chemischen Bibliotheken angewendet werden und umgeht einige der oben genannten Herausforderungen.

Protocol

1. Expression von GFP-markierten bakteriellen Zytoskelettproteinen in S. pombe HINWEIS: In Tabelle 1 finden Sie Informationen zu allen hier verwendeten Plasmiden und Stämmen. In Tabelle 2 finden Sie alle Medienzusammensetzungen. Durchführung der Klonierung von E. coli MreB mit einer N-terminalen GFP-Fusion (GFP-MreB) und S. aureus FtsZ mit einem C-terminalen GFP (SaFtsZ-GFP) in den S. pombe-Expressio…

Representative Results

Aufbau der 96-Well-Platte für das Screening von MedikamentenDie Verwendung von S. pombe zur Expression eines C-terminalen GFP-markierten S. aureus FtsZ aus einem Vektor (pREP42), der den mittelstarken thiaminhaltigen repressiblen Promotor nmt41enthält, wurde zuvor nachgewiesen17 und in ähnlicher Weise wurde das mit N- terminalem GFP markierte E. coli MreB auch in S. pombe14 exprimiert. Wir haben auch gezei…

Discussion

Antimikrobielle Resistenzen (AMR) sind eine ernsthafte globale Gesundheitsbedrohung, und es besteht ein dringender Bedarf an neuen Antibiotika mit neuen Zielen. Das bakterielle Zytoskelett hat sich als attraktives Ziel für die Entwicklung neuer Antibiotika erwiesen, wobei sich niedermolekulare Inhibitoren des Zellteilungsproteins FtsZ, wie TXA709, bereits in klinischen Phase-I-Studien^{befinden 30}. Es wurden mehrere Methoden entwickelt, um Inhibitoren der FtsZ-Polymerisation^{zu ide…}

Materials

96 Well CC2 Optical CVG Sterile, w/Lid. Black	Thermo Scientific™	160376
96-well plate	Corning	CLS3370
A22 Hydrochloride	Sigma	SML0471	Dissolved in DMSO
Adenine	FormediumTM	DOC0229	225 mg/L of media
Concanavalin A	Sigma	C5275-5MG
DMSO	Sigma	317275
Edinburg minimal medium (EMM Agar or EMM Broth)	FormediumTM	PMD0210	See below for composition
EDTA	Sigma	EDS-500G
epMotion® 96 with 2-position slider	Eppendorf	5069000101
Histidine	FormediumTM	DOC0144	225 mg/L of media
Leica DMi8 inverted fluorescence microscope	Leica Microsystems		German company
Leucine	FormediumTM	DOC0157	225 mg/L of media
Lithium acetate	Sigma	517992-100G
PC190723	Merck	344580	Dissolved in DMSO
Polyethylene glycol (PEG)	Sigma	202398
Thiamine	Sigma	T4625	Filter sterilised
Tris-Hydrochloride	MP	194855
Uracil	FormediumTM	DOC0214	225 mg/L of media, Store solution at 36°C
YES (Yeast extract + supplements) Agar	FormediumTM	PCM0410	See below for composition
YES (Yeast extract + supplements) Broth	FormediumTM	PCM0310	See below for composition
Yeast (S. pombe) media
Yeast extract + supplements (YES)
	Composition	g/L
	Yeast extract	5
	Dextrose	30
	Agar	17
	Adenine	0.05
	L-Histidine	0.05
	L-Leucine	0.05
	L-Lysine HCl	0.05
	Uracil	0.05
Edinburg minimal medium (EMM)
	Composition	g/L	concentration
	potassium hydrogen phthallate	3	14.7mM
	Na2HPO4	2.2	15.5 mM
	NH4Cl	5	93.5 mM
	glucose	2% (w/v) or 20 g/L	111 mM
	Salts (stock x 50)	20 mL/L (v/v)
	Vitamins (stock x 1000)	1 mL/L (v/v)
	Minerals (Stock x 10,000)	0.1 mL/L (v/v)
Salts x 50	52.5 g/l MgCl2.6H20 (0.26 M)	52.5	0.26 M
	0.735 mg/l CaCl2.2H20 (4.99 mM)	0.000735	4.99 mM
	50 g/l KCl (0.67 M)	50	0.67 M
	2 g/l Na2SO4 (14.l mM)	2	14.1 mM
Vitamins x 1000	1 g/l pantothenic acid	1	4.20 mM
	10 g/l nicotinic acid	10	81.2 mM
	10 g/l inositol	10	55.5 mM
	10 mg/l biotin	0.01	40.8 µM
Minerals x 10,000	boric acid	5	80.9 mM
	MnSO4	4	23.7 mM
	ZnSO4.7H2O	4	13.9 mM
	FeCl2.6H2O	2	7.40 mM
	molybdic acid	0.4	2.47 mM
	KI	1	6.02 mM
	CuSO4.5H2O	0.4	1.60 mM
	citric acid	10	47.6 mM
Strains/ Plasmids
Strains	Description	Reference
CCD190	Escherichia coli DH10β	Invitrogen
CCDY4	MBY3532; CCDY346/pREP42- GFP-EcMreB	Srinivasan et al., 2007
CCDY340	CCDY346/pREP42- SaFtsZ-GFP	Sharma et al., 2023
CCDY346	MBY192; Schizosaccharomyces pombe [ura4-D18, leu1-32, h-]	Dr. Mithilesh Mishra (DBS, TIFR)
Plasmids
pCCD3	pREP42-GFP-EcMreB	Srinivasan et al., 2007
pCCD713	pREP42-SaFtsZ-GFP	Sharma et al., 2023