박테리아 세포골격 단백질을 표적으로 하는 항균 약물 스크리닝을 위한 플랫폼으로서의 핵분열 효모

요약

핵분열 효모는 FtsZ 및 MreB와 같은 박테리아 세포골격 단백질을 GFP와 함께 번역 융합 단백질로 발현하여 중합을 시각화하는 이종 숙주로 사용됩니다. 또한 중합에 영향을 미치는 화합물은 형광 현미경을 사용하여 이미징하여 식별합니다.

초록

FtsZ 및 MreB와 같은 박테리아 세포골격 단백질은 세포 분열 및 세포 형태 유지와 같은 필수 기능을 수행합니다. 또한 FtsZ와 MreB는 새로운 항균제 발견을 위한 중요한 표적으로 부상했습니다. 이러한 세포골격 단백질의 뉴클레오티드 결합 및 중합을 표적으로 하는 화합물을 식별하기 위해 여러 분석법이 개발되었으며, 주로 FtsZ에 초점을 맞추고 있습니다. 더욱이, 많은 분석법은 힘들거나 비용이 많이 들며, 이러한 단백질이 약물의 세포 표적인지 여부를 확인하려면 여러 가지 방법이 필요한 경우가 많습니다. 마지막으로, 진핵 세포에 대한 약물의 독성도 문제를 제기합니다. 여기에서는 박테리아 세포골격을 표적으로 하는 새로운 분자를 발견하고 진핵 세포에 잠재적으로 독성이 있을 수 있는 공격을 최소화하기 위한 단일 단계 세포 기반 분석에 대해 설명합니다. 핵분열 효모는 현미경을 기반으로 한 고처리량 스크리닝에 적합하며, 육안 스크리닝은 FtsZ 또는 MreB의 중합을 변경하는 모든 분자를 쉽게 식별할 수 있습니다. 당사의 분석은 표준 96웰 플레이트를 사용하며 분열 효모와 같은 진핵 세포에서 중합하는 박테리아 세포골격 단백질의 능력에 의존합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 핵분열 효모에 대한 것이며 황색포도상구균 의 FtsZ와 대장균의 MreB를 활용하지만, 모든 진핵생물 발현 호스트에서 고분자로 쉽게 조립되는 다른 박테리아 세포골격 단백질에 쉽게 적용할 수 있습니다. 여기에 설명된 방법은 박테리아 세포골격 단백질을 표적으로 하는 새로운 항균제의 추가 발견을 촉진하는 데 도움이 될 것입니다.

서론

현재 세균 감염을 퇴치하기 위해 사용되는 거의 모든 항생제에 대한 광범위한 내성으로 인해 새로운 범주의 항생제가 즉시 필요하게 되었습니다. 2019년 보고서에 따르면 항생제 내성 감염으로 인해 127만 명이 목숨을 잃었으며, 내성 세균 감염으로 인한 합병증을 고려할 때 총 495만 명이 사망한 것으로 집계되었습니다¹. 임상에서는 여전히 효과적이지만, 현재 사용되는 항생제는 주로 세포벽, DNA 및 단백질 합성에 초점을 맞춘 좁은 범위의 세포 과정을 표적으로 합니다. 지난 반세기 동안 새로운 항균제 ^2,3 개발의 대상으로 상업적으로 이용된 단백질은 30개 미만입니다. 이처럼 실행 가능한 표적의 범위가 제한되어 있기 때문에 항생제 내성 박테리아와 싸우기 위한 새로운 항생제 또는 그 유도체를 발견하는 데 상당한 제약이 있습니다. 따라서 새로운 항생제 내성 문제를 극복하기 위해서는 새로운 표적과 작용 기전을 가진 새로운 항생제의 개발이 필요합니다.

항균 표적은 이상적으로 박테리아 세포 성장의 필수 구성 요소여야 하고, 계통 발생학적으로 다양한 종 전체에 걸쳐 보존되어야 하며, 진핵생물 상동성이 가장 적어....

프로토콜

1. S. pombe에서 GFP 표지된 세균 세포골격 단백질의 발현

NOTE: 여기에 사용된 모든 plasmids 및 strain에 대한 정보는 표 1 을 참조하십시오. 모든 미디어 구성에 대해서는 표 2 를 참조하십시오.

1. N-말단 GFP 융합(GFP-MreB) 및 C-말단 GFP(SaFtsZ-GFP)를 운반하는 S. aureus FtsZ를 S. pombe 발현 벡터, pREP42에 앞서 설명한 바와 같이 중간 강도의 티아민-억제성 프로모터, nmt41^18,19로 클로닝을 수행합니다^14,15. ^20,21에 설명된 대로 E. coli 균주(DH10β)에서 플라스미드를 유지, 증폭 및 분리합니다.
   참고: DH5α, XL1Blu....

결과

약물 스크리닝을 위한 96웰 플레이트 설정
중-강도 티아민 억제성 프로모터 nmt41을 함유하는 벡터(pREP42)로부터 C-말단 GFP 표지된 S. aureus FtsZ를 발현하기 위한 S. pombe의 사용은 사전에 확립된¹⁷ 및 유사하게, N-말단 GFP로 표지된 E. coli MreB도 S. pombe¹⁴에서 발현되었다. 우리는 또한 SaFtsZ의 특정 억제제인 PC190723와 MreB 억제제인 A22가 효모^14,17에서 발현될 때 특정 방식으로 각각의 박테리아 세포골격 단백질에 영향을 미칠 수 있음을 보여주었습니다.

여기에서 우리는 효모 발현 시스템을 사용하여 박테리.......

토론

항생제 내성(AMR)은 전 세계적으로 심각한 건강 위협이며, 새로운 표적을 가진 새로운 항생제가 시급히 필요합니다. 박테리아 세포골격은 TXA709와 같은 세포 분열 단백질 FtsZ의 저분자 억제제와 함께 새로운 항생제 개발을 위한 매력적인 대상으로 부상했으며, 이미 1상 임상시험에서³⁰. FtsZ^{중합 7,31}의 억제제를 확인하기 위해 여러 가지 방법이 개발되었습니다. 최근에는 세포 기반 분석에서 진핵생물 핵분열 효모를 사용하여 FtsZ 안정화 약물인 PC190723가 HpFtsZ¹⁷을 표적으로 할 수 있음을 보여주었습니다. 또한, 베르베린(berberine) 및 상귀나린(sanguinarine)과 같은 약물이 FtsZ의 중합에 영향을 미치지만 효모 세포의 형태에도 영향을 미친다는 것을 보여주었습니다¹⁷

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
96웰 CC2 광학 CVG 멸균, 뚜껑 포함. 블랙	써모 사이언티픽&트레이드;
96웰 플레이트	Corning
A22 하이드로클로라이드	시그마	SML0471	DMSO
아데닌	FormediumTM	DOC0229	225 mg/L의 배지에 용해됨
콘카나발린 A	시그마	C5275-5MG
DMSO	시그마
Edinburg 최소 매체 (EMM 한천 또는 EMM 국물)	FormediumTM	PMD0210	구성에 대해서는 아래를 참조하십시오
. EDTA	시그마	EDS-500G
epMotion® 96 with 2-position slider	Eppendorf	5069000101
Histidine	FormediumTM		DOC0144 225 mg/L의 매체
Leica DMi8 반전 형광 현미경	Leica Microsystems		독일 회사
Leucine	FormediumTM	DOC0157	225 mg/L의 매체
리튬 아세테이트	시그마	517992-100G
PC190723	머크	344580	DMSO
폴리에틸렌 글리콜 (PEG)	그마
티아민	시그마	T4625	필터 멸균
Tris-Hydrochloride	MP	194855
Uracil	FormediumTM	DOC0214	225 mg/L의 매체, 저장 용액 36°C; C
YES (효모 추출물 + 보충제) Agar	FormediumTM	PCM0410	구성은 아래를 참조하십시오
예 (효모 추출물 + 보충제) Broth	FormediumTM	PCM0310	구성
Yeast (S. pombe) media  < / strong>
효모 추출물 + 보충제 (YES) < / strong >< / em >
	< strong > 구성< / strong >	< strong >g / L < / strong >
	효모 추출물	5
	포도당	30
	한천	17
	아데닌	0.05
	L-히스티딘	0.05
	L-류신	0.05
	L-라이신, HCl	0.05
	우라실	0.05
Edinburg 최소 매체(EMM)
	구성	g/L	농도
	potassium hydrogen phthallate	3	14.7mM
	Na2HPO4	2.2	15.5 mM
	NH4Cl	5	93.5 mM
	포도당	2% (w/v) 또는 20 g/L	111 mM
	소금 (재고 x 50)	20 mL/L (v/v)
	비타민 (재고 x 1000)	1 mL/L (v/v)
	미네랄 (재고 x 10,000)	0.1 mL/L (v/v)
<강한>소금 x 50	52.5 g/l MgCl2.6H20 (0.26 M)	52.5	0.26 M
	0.735 mg/l CaCl2.2H20 (4.99 mM)	0.000735	4.99 mM
	50 g/l KCl (0.67 M)	50	0.67 M
	2 g/l Na2SO4 (14.l mM)	2	14.1 mM
<강력한>비타민 x 1000	1 g/l 판토텐산	1	4.20 mM
	10 g/l 니코틴산	10	81.2 mM
	10 g/l 이노시톨	10	55.5 mM
	10 mg/l 비오틴	0.01	40.8 &마이크로; M
미네랄 x 10,000	붕산	5	80.9 mM
	MnSO4	4	23.7 mM
	ZnSO4.7H2O	4	13.9 mM
	FeCl2.6H2O	2	7.40 mM
	몰리브딕산	0.4	2.47 mM
	키	1	6.02 mM
	CuSO4.5H2O	0.4	1.60 mM
	구연산	10	47.6 mM
Strains/ Plasmids
Strains	Description	Reference
CCD190	Escherichia coli DH10β	인비트로젠
CCDY4	MBY3532; CCDY346/pREP42- GFP-EcMreB	Srinivasan et al., 2007
	CCDY340 CCDY346/pREP42- SaFtsZ-GFP	Sharma et al., 2023
	CCDY346 MBY192; Schizosaccharomyces pombe [ura4-D18, leu1-32, h-]	Dr. Mithilesh Mishra (DBS, TIFR)
Plasmids
pCCD3	pREP42-GFP-EcMreB	Srinivasan 외, 2007
pCCD713	pREP42-SaFtsZ-GFP	Sharma 외, 2023

160376CLS3370317275에 용해 시202398, , , , , , ,