Fisjonsgjær som en plattform for antibakterielle stoffskjermer rettet mot bakterielle cytoskjelettproteiner

Summary

Fisjonsgjær brukes her som en heterolog vert for å uttrykke bakterielle cytoskeletale proteiner som FtsZ og MreB som translasjonelle fusjonsproteiner med GFP for å visualisere polymerisasjonen. Også forbindelser som påvirker polymerisasjonen identifiseres ved avbildning ved hjelp av et fluorescensmikroskop.

Abstract

Bakterielle cytoskjelettproteiner som FtsZ og MreB utfører viktige funksjoner som celledeling og vedlikehold av celleformer. Videre har FtsZ og MreB dukket opp som viktige mål for ny antimikrobiell oppdagelse. Flere analyser er utviklet for å identifisere forbindelser rettet mot nukleotidbinding og polymerisering av disse cytoskeletale proteiner, primært fokusert på FtsZ. Videre er mange av analysene enten arbeidskrevende eller kostnadskrevende, og å fastslå om disse proteinene er det cellulære målet for stoffet krever ofte flere metoder. Endelig utgjør stoffets toksisitet til eukaryote celler også et problem. Her beskriver vi en enkelt-trinns cellebasert analyse for å oppdage nye molekyler rettet mot bakterielt cytoskjelett og minimere treff som kan være potensielt giftige for eukaryote celler. Fisjonsgjær er egnet til skjermer med høy gjennomstrømning basert på mikroskopi, og en visuell skjerm kan enkelt identifisere ethvert molekyl som endrer polymerisasjonen av FtsZ eller MreB. Vår analyse benytter standard 96-brønnplaten og er avhengig av bakterielle cytoskeletale proteiners evne til å polymerisere i en eukaryot celle som fisjonsgjæren. Mens protokollene beskrevet her er for fisjonsgjær og bruker FtsZ fra Staphylococcus aureus og MreB fra Escherichia coli, kan de lett tilpasses andre bakterielle cytoskeletale proteiner som lett samles til polymerer i alle eukaryote uttrykksverter. Metoden beskrevet her skal bidra til å lette videre oppdagelse av nye antimikrobielle stoffer rettet mot bakterielle cytoskjelettproteiner.

Introduction

Den utbredte resistensen mot nesten alle antibiotika som for tiden brukes til å bekjempe bakterielle infeksjoner, har skapt en umiddelbar nødvendighet for nye kategorier av antibiotika. En rapport fra 2019 indikerte at antibiotikaresistente infeksjoner resulterte i tap av 1,27 millioner liv, noe som bidro til en samlet opptelling på 4,95 millioner dødsfall når man vurderer komplikasjoner fra resistente bakterielle infeksjoner¹. Mens det fortsatt er effektivt i klinisk praksis, retter det nåværende arsenalet av antibiotika seg hovedsakelig mot et smalt spekter av cellulære prosesser, primært med fokus på cellevegg, DNA og proteinsyntese. I løpet av det siste halve århundre har færre enn 30 proteiner blitt kommersielt utnyttet som mål for utvikling av nye antibakterielle midler ^2,3. Dette begrensede utvalget av levedyktige mål skaper betydelig begrensninger for å oppdage nye antibiotika eller deres derivater for å bekjempe antibiotikaresistente bakterier. For å overvinne det fremvoksende antibiotikaresistensproblemet er det derfor behov for utvikling av nye antibiotika med nye mål og virkningsmekanismer.

Et antibakterielt mål bør ideelt sett være en viktig komponent i bakteriell cellevekst, bevares gjennom de fylogenetisk forskjellige artene, vise minst eukaryot homologi og være tilgjengelig for antibiotika⁴. Siden oppdagelsen av bakterielle cytoskjelettproteiner involvert i celledeling og vedlikehold av celleformer, har de dukket opp som et lovende fokuspunkt for utvikling av antibakterielle forbindelser⁵. Disse proteinene er essensielle for bakteriell levedyktighet og spiller en sentral rolle i å opprettholde celleform (MreB, CreS), divisjon (FtsZ, FtsA) og DNA-segregering (ParM, TubZ, PhuZ, AlfA), beslektet med cytoskelettet i eukaryote celler. Spesielt viser FtsZ et bemerkelsesverdig høyt bevaringsnivå over et bredt spekter av prokaryote organismer, mens MreB finnes i nesten alle stavformede bakterier. En slik bred distribusjon og relevans i cellenes levedyktighet gjør disse proteinene til et fascinerende mål i antibiotikaforskning ^5,6,7.

Det er avgjørende å vedta en flersidig tilnærming som kombinerer in vivo-observasjoner, in vitro-interaksjoner og enzymatiske eksperimenter for grundig å validere bakterielle cytoskjelettproteiner som det primære målet for en potensiell inhibitor⁷. Arbeidskrevende prosedyrer eller betydelige kostnadsimplikasjoner belaster mange tilgjengelige analyser for dette formålet. Dette er bemerkelsesverdige hindringer for deres utbredte bruk i screening av blyforbindelser som kan påvirke bakteriell cytoskelett. Blant disse skiller mikroskopi seg ut som en eksepsjonelt effektiv og rask metode for å vurdere effektiviteten av forbindelser ved direkte å undersøke endringer i cellemorfologi. Likevel gjør hetero-assosiasjonen av målprotein med andre cytoskelettkomplekser, indirekte effekter på grunn av off-target binding og endringer i membranpotensial, vanskeligheter med å trenge inn i cellen effektivt, og tilstedeværelse av efflukspumper, spesielt i gramnegative bakterier, det kollektivt komplisert å finne den nøyaktige årsaken til bakteriell celledeformasjon ^8,9,10.

Schizosaccharomyces pombe, eller fisjonsgjær som det er kjent, er en stavformet encellet eukaryot organisme. Fisjonsgjær er mye brukt som modellorganisme i cellulær og molekylærbiologi på grunn av den ekstraordinære bevaringen i cellulære prosesser som cellesyklus og deling, cellulær organisasjon og kromosomreplikasjon med høyere eukaryoter, inkludert mennesker^11,12. Videre uttrykte Errington og kolleger et pollokalisert bakterielt cytoskjelettprotein DivIVA i fisjonsgjær for å demonstrere at DivIVA akkumulerte på negativt buede overflater¹³. Igjen hadde Balasubramanian og gruppen først etablert fisjonsgjær som et cellulært modellsystem for å gi ny innsikt i mekanismen, monteringen og dynamikken til E. coli-aktincytoskjelettproteinet som MreB¹⁴ og tubulinhomolog FtsZ¹⁵. De demonstrerer også evnen til A22 til effektivt å hindre polymerisasjonen av MreB gjennom epifluorescensmikroskopi når det uttrykkes i gjær¹⁴. Etter dette har andre grupper også med hell benyttet fisjonsgjær for å studere monteringsegenskapene til kloroplast FtsZ1 og FtsZ2 proteiner¹⁶. Mer nylig har vi etablert et proof-of-concept av levedyktigheten ved bruk av fisjonsgjær som en cellulær plattform for å spesifikt screene for bakterielle cytoskeletthemmere ved å gjennomføre en omfattende vurdering av virkningen av tre kjente FtsZ-hemmere – sanguinarin, berberin og PC190723-on FtsZ-proteiner avledet fra to patogene bakterier, nemlig Staphylococcus aureus og Helicobacter pylori¹⁷. I tillegg viser denne enkelttrinnscellebaserte analysen seg medvirkende til å minimere risikoen for å identifisere forbindelser som kan være potensielt giftige for eukaryote celler.

I denne rapporten, ved hjelp av fisjonsgjærsystemet, foreslår vi en systematisk arbeidsflyt ved bruk av standard 96-brønnplate for halvautomatisert screening og kvantifisering av effekten av småmolekylhemmere rettet mot FtsZ fra Staphylococcus aureus og MreB fra Escherichia coli. Her setter vi opp og optimaliserer den halvautomatiserte arbeidsflyten ved hjelp av de etablerte hemmerne PC190723 og A22 som spesifikt retter seg mot henholdsvis FtsZ og MreB. Denne arbeidsflyten bruker et epifluorescensmikroskop utstyrt med et motorisert trinn med høy presisjon og automatisert bildeinnsamling i en standard 96-brønnsplate for å forbedre dagens standardisering. Derfor kan den brukes på skjermer med middels så vel som høy gjennomstrømning av syntetiske kjemiske biblioteker og omgår noen av utfordringene som er oppført ovenfor.

Protocol

1. Ekspresjon av GFP-merkede bakterielle cytoskjelettproteiner i S. pombe MERK: Se tabell 1 for informasjon om alle plasmider og stammer som brukes her. Se tabell 2 for alle mediekomposisjoner. Utfør kloning av E. coli MreB med en N-terminal GFP-fusjon (GFP-MreB) og S. aureus FtsZ som fører en C-terminal GFP (SaFtsZ-GFP) inn i S. pombe-ekspresjonsvektoren, pREP42 med en middels sterk tiaminrepre…

Representative Results

Sette opp 96-brønnplaten for screening av narkotikaBruk av S. pombe for å uttrykke en C- terminalt GFP-merket S. aureus FtsZ fra en vektor (pREP42) som inneholder den middels sterke tiaminundertrykkbare promotoren nmt41har tidligere blitt etablert17 og tilsvarende ble E. coli MreB merket med N- terminal GFP også uttrykt i S. pombe14. Vi har også vist at PC190723, en spesifikk hemmer av SaFtsZ og A22, en M…

Discussion

Antimikrobiell resistens (AMR) er en alvorlig global helsetrussel, og det er et presserende behov for nye antibiotika med nye mål. Det bakterielle cytoskjelettet har dukket opp som et attraktivt mål for å utvikle nye antibiotika, med småmolekylære hemmere av celledelingsproteinet FtsZ, som TXA709, allerede i fase I kliniske studier³⁰. Flere metoder er utviklet for å identifisere inhibitorer av FtsZ-polymerisasjon ^7,31. Vi har nylig b…

Materials

96 Well CC2 Optical CVG Sterile, w/Lid. Black	Thermo Scientific™	160376
96-well plate	Corning	CLS3370
A22 Hydrochloride	Sigma	SML0471	Dissolved in DMSO
Adenine	FormediumTM	DOC0229	225 mg/L of media
Concanavalin A	Sigma	C5275-5MG
DMSO	Sigma	317275
Edinburg minimal medium (EMM Agar or EMM Broth)	FormediumTM	PMD0210	See below for composition
EDTA	Sigma	EDS-500G
epMotion® 96 with 2-position slider	Eppendorf	5069000101
Histidine	FormediumTM	DOC0144	225 mg/L of media
Leica DMi8 inverted fluorescence microscope	Leica Microsystems		German company
Leucine	FormediumTM	DOC0157	225 mg/L of media
Lithium acetate	Sigma	517992-100G
PC190723	Merck	344580	Dissolved in DMSO
Polyethylene glycol (PEG)	Sigma	202398
Thiamine	Sigma	T4625	Filter sterilised
Tris-Hydrochloride	MP	194855
Uracil	FormediumTM	DOC0214	225 mg/L of media, Store solution at 36°C
YES (Yeast extract + supplements) Agar	FormediumTM	PCM0410	See below for composition
YES (Yeast extract + supplements) Broth	FormediumTM	PCM0310	See below for composition
Yeast (S. pombe) media
Yeast extract + supplements (YES)
	Composition	g/L
	Yeast extract	5
	Dextrose	30
	Agar	17
	Adenine	0.05
	L-Histidine	0.05
	L-Leucine	0.05
	L-Lysine HCl	0.05
	Uracil	0.05
Edinburg minimal medium (EMM)
	Composition	g/L	concentration
	potassium hydrogen phthallate	3	14.7mM
	Na2HPO4	2.2	15.5 mM
	NH4Cl	5	93.5 mM
	glucose	2% (w/v) or 20 g/L	111 mM
	Salts (stock x 50)	20 mL/L (v/v)
	Vitamins (stock x 1000)	1 mL/L (v/v)
	Minerals (Stock x 10,000)	0.1 mL/L (v/v)
Salts x 50	52.5 g/l MgCl2.6H20 (0.26 M)	52.5	0.26 M
	0.735 mg/l CaCl2.2H20 (4.99 mM)	0.000735	4.99 mM
	50 g/l KCl (0.67 M)	50	0.67 M
	2 g/l Na2SO4 (14.l mM)	2	14.1 mM
Vitamins x 1000	1 g/l pantothenic acid	1	4.20 mM
	10 g/l nicotinic acid	10	81.2 mM
	10 g/l inositol	10	55.5 mM
	10 mg/l biotin	0.01	40.8 µM
Minerals x 10,000	boric acid	5	80.9 mM
	MnSO4	4	23.7 mM
	ZnSO4.7H2O	4	13.9 mM
	FeCl2.6H2O	2	7.40 mM
	molybdic acid	0.4	2.47 mM
	KI	1	6.02 mM
	CuSO4.5H2O	0.4	1.60 mM
	citric acid	10	47.6 mM
Strains/ Plasmids
Strains	Description	Reference
CCD190	Escherichia coli DH10β	Invitrogen
CCDY4	MBY3532; CCDY346/pREP42- GFP-EcMreB	Srinivasan et al., 2007
CCDY340	CCDY346/pREP42- SaFtsZ-GFP	Sharma et al., 2023
CCDY346	MBY192; Schizosaccharomyces pombe [ura4-D18, leu1-32, h-]	Dr. Mithilesh Mishra (DBS, TIFR)
Plasmids
pCCD3	pREP42-GFP-EcMreB	Srinivasan et al., 2007
pCCD713	pREP42-SaFtsZ-GFP	Sharma et al., 2023