Bakteriyel hücre iskeleti proteinlerini hedef alan antibakteriyel ilaç taramaları için bir platform olarak fisyon mayası
Summary
Fisyon mayası burada, polimerizasyonlarını görselleştirmek için GFP ile translasyonel füzyon proteinleri olarak FtsZ ve MreB gibi bakteriyel hücre iskeleti proteinlerini eksprese etmek için heterolog bir konakçı olarak kullanılır. Ayrıca, polimerizasyonu etkileyen bileşikler, bir floresan mikroskobu kullanılarak görüntüleme ile tanımlanır.
Abstract
FtsZ ve MreB gibi bakteriyel hücre iskeleti proteinleri, hücre bölünmesi ve hücre şeklinin korunması gibi temel işlevleri yerine getirir. Ayrıca, FtsZ ve MreB, yeni antimikrobiyal keşifler için önemli hedefler olarak ortaya çıkmıştır. Bu hücre iskeleti proteinlerinin nükleotid bağlanmasını ve polimerizasyonunu hedefleyen bileşikleri tanımlamak için, esas olarak FtsZ’ye odaklanan çeşitli testler geliştirilmiştir. Dahası, tahlillerin çoğu ya zahmetli ya da maliyet yoğundur ve bu proteinlerin ilacın hücresel hedefi olup olmadığını belirlemek genellikle birden fazla yöntem gerektirir. Son olarak, ilaçların ökaryotik hücrelere toksisitesi de bir sorun teşkil etmektedir. Burada, bakteri hücre iskeletini hedef alan yeni molekülleri keşfetmek ve ökaryotik hücreler için potansiyel olarak toksik olabilecek isabetleri en aza indirmek için tek adımlı hücre bazlı bir tahlili açıklıyoruz. Fisyon mayası, mikroskopiye dayalı yüksek verimli ekranlara uygundur ve görsel bir ekran, FtsZ veya MreB’nin polimerizasyonunu değiştiren herhangi bir molekülü kolayca tanımlayabilir. Testimiz standart 96 oyuklu plakayı kullanır ve bakteriyel hücre iskeleti proteinlerinin fisyon mayası gibi ökaryotik bir hücrede polimerize olma yeteneğine dayanır. Burada tarif edilen protokoller fisyon mayası için olsa da ve Staphylococcus aureus’tan FtsZ ve Escherichia coli’den MreB’yi kullanırken, herhangi bir ökaryotik ekspresyon konakçısında polimerlere kolayca birleşen diğer bakteriyel hücre iskeleti proteinlerine kolayca uyarlanabilirler. Burada açıklanan yöntem, bakteriyel hücre iskeleti proteinlerini hedef alan yeni antimikrobiyallerin daha fazla keşfedilmesini kolaylaştırmaya yardımcı olacaktır.
Introduction
Bakteriyel enfeksiyonlarla mücadele etmek için şu anda kullanılan hemen hemen tüm antibiyotiklere karşı yaygın direnç, yeni antibiyotik kategorileri için acil bir gereklilik yaratmıştır. 2019 tarihli bir rapor, antibiyotiğe dirençli enfeksiyonların 1,27 milyon can kaybına yol açtığını ve dirençli bakteriyel enfeksiyonlardan kaynaklanan komplikasyonlar göz önüne alındığında toplam 4,95 milyon ölüme katkıda bulunduğunu belirtti1. Klinik uygulamada hala etkili olsa da, mevcut antibiyotik cephaneliği ağırlıklı olarak hücre duvarı, DNA ve protein sentezine odaklanan dar bir hücresel süreç spektrumunu hedeflemektedir. Son yarım yüzyıl boyunca, 30’dan az protein, yeni anti-bakteriyellerin geliştirilmesi için hedef olarak ticari olarak kullanılmıştır 2,3. Bu sınırlı uygulanabilir hedef yelpazesi, antibiyotiğe dirençli bakterilerle mücadele için yeni antibiyotiklerin veya türevlerinin keşfedilmesinde önemli ölçüde kısıtlamalar yaratır. Bu nedenle, ortaya çıkan antibiyotik direnci sorununun üstesinden gelmek için, yeni hedefleri ve etki mekanizmaları olan yeni antibiyotiklerin geliştirilmesine ihtiyaç vardır.
Bir antibakteriyel hedef ideal olarak bakteriyel hücre büyümesinin önemli bir bileşeni olmalı, filogenetik olarak çeşitli türler boyunca korunmalı, en az ökaryotik homoloji göstermeli ve antibiyotikler için erişilebilir olmalıdır4. Hücre bölünmesi ve hücre şeklinin korunmasında rol oynayan bakteriyel hücre iskeleti proteinlerinin keşfinden bu yana, antibakteriyel bileşiklerin geliştirilmesi için umut verici bir odak noktası olarak ortaya çıkmıştır5. Bu proteinler bakteri canlılığı için gereklidir ve ökaryotik hücrelerdeki hücre iskeletine benzer şekilde hücre şeklinin (MreB, CreS), bölünmenin (FtsZ, FtsA) ve DNA ayrışmasının (ParM, TubZ, PhuZ, AlfA) korunmasında çok önemli bir rol oynar. Özellikle, FtsZ, çok çeşitli prokaryotik organizmalarda oldukça yüksek bir koruma seviyesi sergilerken, MreB neredeyse tüm çubuk şeklindeki bakterilerde bulunur. Hücre canlılığındaki bu kadar geniş dağılım ve alaka düzeyi, bu proteinleri antibiyotik araştırmalarında büyüleyici bir hedef haline getirmektedir 5,6,7.
Potansiyel bir inhibitörün7 birincil hedefi olarak bakteriyel hücre iskeleti proteinlerini kapsamlı bir şekilde doğrulamak için in vivo gözlemleri, in vitro etkileşimleri ve enzimatik deneyleri birleştiren çok yönlü bir yaklaşım benimsemek çok önemlidir. Zahmetli prosedürler veya önemli maliyet etkileri, bu amaç için mevcut birçok tahlili zorunlu kılar. Bunlar, bakteri hücre iskeletini etkileyebilecek kurşun bileşiklerinin taranmasında yaygın olarak kullanılmalarının önündeki dikkate değer engellerdir. Bunlar arasında mikroskopi, hücre morfolojisindeki değişiklikleri doğrudan inceleyerek bileşiklerin etkinliğini değerlendirmek için son derece verimli ve hızlı bir yöntem olarak öne çıkıyor. Yine de, hedef proteinin diğer hücre iskeleti kompleksleri ile hetero-ilişkisi, hedef dışı bağlanma ve zar potansiyelindeki değişikliklerden kaynaklanan dolaylı etkiler, hücreye verimli bir şekilde nüfuz etmedeki zorluk ve özellikle Gram-negatif bakterilerde akış pompalarının varlığı, bakteriyel hücre deformasyonunun kesin nedenini belirlemek için toplu olarak karmaşık hale getirir 8,9,10.
Schizosaccharomyces pombe veya yaygın olarak bilinen adıyla fisyon mayası, çubuk şeklinde tek hücreli ökaryotik bir organizmadır. Fisyon mayası, hücre döngüsü ve bölünmesi, hücresel organizasyon ve insanlar da dahil olmak üzere daha yüksek ökaryotlarla kromozom replikasyonu gibi hücresel süreçlerdeki olağanüstü koruma nedeniyle hücresel ve moleküler biyolojide model organizma olarak yaygın olarak kullanılmaktadır11,12. Ayrıca, Errington ve meslektaşları, DivIVA’nın negatif kavisli yüzeylerde biriktiğini göstermek için fisyon mayasında kutup lokalize bir bakteriyel hücre iskeleti proteini DivIVA’yı ifade ettiler13. Yine Balasubramanian ve grubu, MreB14 ve tubulin homologu FtsZ15 gibi E. coli aktin hücre iskeleti proteininin mekanizması, montajı ve dinamiği hakkında yeni bilgiler getirmek için hücresel bir model sistem olarak fisyon mayasını ilk kez kurmuştu. Ayrıca, A22’nin, maya14’te eksprese edildiğinde epifloresan mikroskobu yoluyla MreB’nin polimerizasyonunu verimli bir şekilde engelleme yeteneğini de gösterirler. Bunu takiben, diğer gruplar da kloroplast FtsZ1 ve FtsZ2 proteinlerinin16 montaj özelliklerini incelemek için fisyon mayasını başarıyla kullandılar. Daha yakın zamanlarda, bilinen üç FtsZ inhibitörünün-sanguinarin, berberin ve PC190723 FtsZ proteinlerinin etkisinin kapsamlı bir değerlendirmesini yaparak, bakteriyel hücre iskeleti inhibitörlerini spesifik olarak taramak için hücresel bir platform olarak fisyon mayasının kullanımının uygulanabilirliğine dair bir kavram kanıtı oluşturduk . Ek olarak, bu tek adımlı hücre bazlı tahlil, ökaryotik hücreler için potansiyel olarak toksik olabilecek bileşikleri tanımlama riskini en aza indirmede etkili olduğunu kanıtlamaktadır.
Bu raporda, fisyon mayası sistemini kullanarak, Staphylococcus aureus’tan FtsZ’yi ve Escherichia coli’den MreB’yi hedefleyen küçük molekül inhibitörlerinin etkisinin yarı otomatik taraması ve nicelleştirilmesi için standart 96 oyuklu plakayı kullanarak sistematik bir iş akışı öneriyoruz. Burada, özellikle FtsZ ve MreB’yi hedefleyen yerleşik inhibitörler PC190723 ve A22’yi kullanarak yarı otomatik iş akışını kuruyor ve optimize ediyoruz. Bu iş akışı, mevcut standardizasyonu iyileştirmek için motorlu yüksek hassasiyetli bir aşama ve standart 96 oyuklu bir plakada otomatik görüntü toplama ile donatılmış bir epifloresan mikroskobu kullanır. Bu nedenle, sentetik kimyasal kütüphanelerin orta ve yüksek verimli ekranlarına uygulanabilir ve yukarıda listelenen zorlukların bazılarını aşar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Antimikrobiyal direnç (AMR) ciddi bir küresel sağlık tehdididir ve yeni hedefleri olan yeni antibiyotiklere acil ihtiyaç vardır. Bakteri hücre iskeleti, halihazırda Faz-I klinik çalışmalarda30 olan TXA709 gibi hücre bölünmesi proteini FtsZ’nin küçük moleküllü inhibitörleri ile yeni antibiyotikler geliştirmek için çekici bir hedef olarak ortaya çıkmıştır. FtsZ polimerizasyonunun inhibitörlerini tanımlamak için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SMP, SR ve AKS, Ulusal Bilim Eğitimi ve Araştırma Enstitüsü, Atom Enerjisi Bölümü’nden alınan bursları kabul eder. RS, Atom Enerjisi Bölümü’nden okul içi finansman desteğini kabul eder ve bu çalışma, Biyoteknoloji Bölümü’nden (DBT) RS’ye (BT/PR42977/MED/29/1603/2022) bir araştırma hibesi yoluyla desteklenir. Yazarlar ayrıca protokolün geliştirilmesi boyunca yorumları, önerileri ve tartışmaları için V Badireenath Konkimalla’ya teşekkür eder.
Materials
| 96 Well CC2 Optical CVG Sterile, w/Lid. Black | Thermo Scientific™ | 160376 | |
| 96-well plate | Corning | CLS3370 | |
| A22 Hydrochloride | Sigma | SML0471 | Dissolved in DMSO |
| Adenine | FormediumTM | DOC0229 | 225 mg/L of media |
| Concanavalin A | Sigma | C5275-5MG | |
| DMSO | Sigma | 317275 | |
| Edinburg minimal medium (EMM Agar or EMM Broth) | FormediumTM | PMD0210 | See below for composition |
| EDTA | Sigma | EDS-500G | |
| epMotion® 96 with 2-position slider | Eppendorf | 5069000101 | |
| Histidine | FormediumTM | DOC0144 | 225 mg/L of media |
| Leica DMi8 inverted fluorescence microscope | Leica Microsystems | German company | |
| Leucine | FormediumTM | DOC0157 | 225 mg/L of media |
| Lithium acetate | Sigma | 517992-100G | |
| PC190723 | Merck | 344580 | Dissolved in DMSO |
| Polyethylene glycol (PEG) | Sigma | 202398 | |
| Thiamine | Sigma | T4625 | Filter sterilised |
| Tris-Hydrochloride | MP | 194855 | |
| Uracil | FormediumTM | DOC0214 | 225 mg/L of media, Store solution at 36°C |
| YES (Yeast extract + supplements) Agar | FormediumTM | PCM0410 | See below for composition |
| YES (Yeast extract + supplements) Broth | FormediumTM | PCM0310 | See below for composition |
| Yeast (S. pombe) media | |||
| Yeast extract + supplements (YES) | |||
| Composition | g/L | ||
| Yeast extract | 5 | ||
| Dextrose | 30 | ||
| Agar | 17 | ||
| Adenine | 0.05 | ||
| L-Histidine | 0.05 | ||
| L-Leucine | 0.05 | ||
| L-Lysine HCl | 0.05 | ||
| Uracil | 0.05 | ||
| Edinburg minimal medium (EMM) | |||
| Composition | g/L | concentration | |
| potassium hydrogen phthallate | 3 | 14.7mM | |
| Na2HPO4 | 2.2 | 15.5 mM | |
| NH4Cl | 5 | 93.5 mM | |
| glucose | 2% (w/v) or 20 g/L | 111 mM | |
| Salts (stock x 50) | 20 mL/L (v/v) | ||
| Vitamins (stock x 1000) | 1 mL/L (v/v) | ||
| Minerals (Stock x 10,000) | 0.1 mL/L (v/v) | ||
| Salts x 50 | 52.5 g/l MgCl2.6H20 (0.26 M) | 52.5 | 0.26 M |
| 0.735 mg/l CaCl2.2H20 (4.99 mM) | 0.000735 | 4.99 mM | |
| 50 g/l KCl (0.67 M) | 50 | 0.67 M | |
| 2 g/l Na2SO4 (14.l mM) | 2 | 14.1 mM | |
| Vitamins x 1000 | 1 g/l pantothenic acid | 1 | 4.20 mM |
| 10 g/l nicotinic acid | 10 | 81.2 mM | |
| 10 g/l inositol | 10 | 55.5 mM | |
| 10 mg/l biotin | 0.01 | 40.8 µM | |
| Minerals x 10,000 | boric acid | 5 | 80.9 mM |
| MnSO4 | 4 | 23.7 mM | |
| ZnSO4.7H2O | 4 | 13.9 mM | |
| FeCl2.6H2O | 2 | 7.40 mM | |
| molybdic acid | 0.4 | 2.47 mM | |
| KI | 1 | 6.02 mM | |
| CuSO4.5H2O | 0.4 | 1.60 mM | |
| citric acid | 10 | 47.6 mM | |
| Strains/ Plasmids | |||
| Strains | Description | Reference | |
| CCD190 | Escherichia coli DH10β | Invitrogen | |
| CCDY4 | MBY3532; CCDY346/pREP42- GFP-EcMreB | Srinivasan et al., 2007 | |
| CCDY340 | CCDY346/pREP42- SaFtsZ-GFP | Sharma et al., 2023 | |
| CCDY346 | MBY192; Schizosaccharomyces pombe [ura4-D18, leu1-32, h-] | Dr. Mithilesh Mishra (DBS, TIFR) | |
| Plasmids | |||
| pCCD3 | pREP42-GFP-EcMreB | Srinivasan et al., 2007 | |
| pCCD713 | pREP42-SaFtsZ-GFP | Sharma et al., 2023 |
References
- Antimicrobial Resistance Collaborators. Global burden of bacterial antimicrobial resistance in 2019: a systematic analysis. Lancet. 399 (10325), 629-655 (2022).
- Haselbeck, R., et al. Comprehensive essential gene identification as a platform for novel anti-infective drug discovery. Curr Pharma Des. 8 (13), 1155-1172 (2002).
- Wang, J., et al. Discovery of a small molecule that inhibits cell division by blocking FtsZ, a novel therapeutic target of antibiotics. J Biol Chem. 278 (45), 44424-44428 (2003).
- Sanchez, S., Demain, A. L. . Antibiotics: current innovations and future trends. , (2015).
- Vollmer, W. The prokaryotic cytoskeleton: a putative target for inhibitors and antibiotics. Appl Microbiol Biotechnol. 73 (1), 37-47 (2006).
- Vollmer, W. Targeting the bacterial Z-ring. Chem Biol. 15 (2), 93-94 (2008).
- Kusuma, K. D., Payne, M., Ung, A. T., Bottomley, A. L., Harry, E. J. FtsZ as an antibacterial target: status and guidelines for progressing this avenue. ACS Infect Dis. 5 (8), 1279-1294 (2019).
- Kaul, M., Zhang, Y., Parhi, A. K., Lavoie, E. J., Pilch, D. S. Inhibition of RND-type efflux pumps confers the FtsZ-directed prodrug TXY436 with activity against Gram-negative bacteria. Biochem Pharmacol. 89 (3), 321-328 (2014).
- Casiraghi, A., Suigo, L., Valoti, E., Straniero, V. Targeting bacterial cell division: A binding site-centered approach to the most promising inhibitors of the essential protein FtsZ. Antibiotics. 9 (2), 69 (2020).
- Piddock, L. J. V. Multidrug-resistance efflux pumps – not just for resistance. Nat Rev. Microbiol. 4 (8), 629-636 (2006).
- Käufer, N. F., Simanis, V., Nurse, P. Fission yeast Schizosaccharomyces pombe correctly excises a mammalian RNA transcript intervening sequence. Nature. 318 (6041), 78-80 (1985).
- Vyas, A., Freitas, A. V., Ralston, Z. A., Tang, Z. Fission yeast Schizosaccharomyces pombe: A unicellular micromammal model organism. Curr Prot. 1 (6), e151 (2021).
- Edwards, D. H., Thomaides, H. B., Errington, J. Promiscuous targeting of Bacillus subtilis cell division protein DivIVA to division sites in Escherichia coli and fission yeast. EMBO J. 19 (11), 2719-2727 (2000).
- Srinivasan, R., Mishra, M., Murata-Hori, M., Balasubramanian, M. K. Filament formation of the Escherichia coli actin-related protein, MreB, in fission yeast. Curr Biol. 17 (3), 266-272 (2007).
- Srinivasan, R., Mishra, M., Wu, L., Yin, Z., Balasubramanian, M. K. The bacterial cell division protein FtsZ assembles into cytoplasmic rings in fission yeast. Gene Dev. 22 (13), 1741-1746 (2008).
- TerBush, A. D., Osteryoung, K. W. Distinct functions of chloroplast FtsZ1 and FtsZ2 in Z-ring structure and remodeling. J Cell Biol. 199 (4), 623-637 (2012).
- Sharma, A. K., et al. A mechanism of salt bridge-mediated resistance to FtsZ inhibitor PC190723 revealed by a cell-based screen. Mol Biol Cell. 34 (3), ar16 (2023).
- Basi, G., Schmid, E., Maundrell, K. TATA box mutations in the Schizosaccharomyces pombe nmt1 promoter affect transcription efficiency but not the transcription start point or thiamine repressibility. Gene. 123 (1), 131-136 (1993).
- Moreno, M. B., Durán, A., Carlos Ribas, J. A family of multifunctional thiamine-repressible expression vectors for fission yeast. Yeast. 16 (9), 861-872 (2000).
- Green, M. R., Sambrook, J. Caring for Escherichia coli. Cold Spring Harb Protoc. , (2018).
- Green, M. R., Sambrook, J. Isolation and quantification of DNA. Cold Spring Harb Protoc. , (2018).
- Bähler, J., et al. Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).
- Pande, V., Mitra, N., Bagde, S. R., Srinivasan, R., Gayathri, P. Filament organization of the bacterial actin MreB is dependent on the nucleotide state. J Cell Biol. 221 (5), e202106092 (2022).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
- Zhang, L. Machine learning for enumeration of cell colony forming units. Vis Comput Ind Biomed Art. 5 (1), 26 (2022).
- Moen, E., et al. Deep learning for cellular image analysis. Nat Meth. 16 (12), 1233-1246 (2019).
- Higaki, T. Quantitative evaluation of cytoskeletal organizations by microscopic image analysis. Plant Morphol. 29 (1), 15-21 (2017).
- Henty-Ridilla, J. L., Li, J., Day, B., Staiger, C. J. ACTIN DEPOLYMERIZING FACTOR4 regulates actin dynamics during innate immune signaling in Arabidopsis. Plant Cell. 26 (1), 340-352 (2014).
- Boudaoud, A., et al. an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images. Nat Protoc. 9 (2), 457-463 (2014).
- Butler, M. S., Paterson, D. L. Antibiotics in the clinical pipeline in October 2019. J Antibio. 73 (6), 329-364 (2019).
- Andreu, J. M., Huecas, S., Araújo-Bazán, L., Vázquez-Villa, H., Martín-Fontecha, M. The search for antibacterial inhibitors targeting cell division protein ftsz at its nucleotide and allosteric binding sites. Biomedicines. 10 (8), 1825 (2022).
- Vještica, A., et al. A toolbox of stable integration vectors in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. J Cell Sci. 133 (1), jcs240754 (2020).
- Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nat Meth. 16 (12), 1226-1232 (2019).
- Shaevitz, J. W., Gitai, Z. The structure and function of bacterial actin homologs. Cold Spring Harb Pers Biol. 2 (9), a000364 (2010).
- Hoffman, C. S., Wood, V., Fantes, P. A. An ancient yeast for young geneticists: A primer on the Schizosaccharomyces pombe model system. 유전학. 201 (2), 403-423 (2015).
- Aoi, Y., et al. Dissecting the first and the second meiotic divisions using a marker-less drug-hypersensitive fission yeast. Cell Cycle. 13 (8), 1327-1334 (2014).
- Zhang, J., et al. Improving drug sensitivity of HIV-1 protease inhibitors by restriction of cellular efflux system in a fission yeast model. Pathogens. 11 (7), 804 (2022).
