Base Recording: Eine Technik zur Analyse der Reaktionen von Geschmacksneuronen in Drosophila
Summary
Eine selten verwendete Methode der elektrophysiologischen Aufzeichnung, die Basisaufzeichnung, ermöglicht die Analyse von Merkmalen der Geschmackscodierung, die mit herkömmlichen Aufzeichnungsmethoden nicht untersucht werden können. Die Basenaufzeichnung ermöglicht auch die Analyse von Geschmacksreaktionen auf hydrophobe Reize, die mit herkömmlichen elektrophysiologischen Methoden nicht untersucht werden können.
Abstract
Insekten schmecken die Außenwelt durch Geschmackshaare oder Sensillen, die an ihren Spitzen Poren haben. Wenn ein Sensillum mit einer potenziellen Nahrungsquelle in Kontakt kommt, dringen Verbindungen aus der Nahrungsquelle durch die Pore ein und aktivieren Neuronen im Inneren. Seit über 50 Jahren werden diese Reaktionen mit einer Technik namens Trinkgeldaufzeichnung aufgezeichnet. Diese Methode hat jedoch große Einschränkungen, einschließlich der Unfähigkeit, die neuronale Aktivität vor oder nach dem Reizkontakt zu messen, und der Anforderung, dass Geschmacksstoffe in wässrigen Lösungen löslich sind. Wir beschreiben hier eine Technik, die wir Base Recording nennen und die diese Einschränkungen überwindet. Base Recording ermöglicht die Messung der Aktivität von Geschmacksneuronen vor, während und nach dem Stimulus. Auf diese Weise ermöglicht es eine umfassende Analyse von OFF-Reaktionen, die nach einem Geschmacksreiz auftreten. Es kann verwendet werden, um hydrophobe Verbindungen wie langkettige Pheromone zu untersuchen, die eine sehr geringe Löslichkeit in Wasser aufweisen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Basenaufzeichnung die Vorteile der Einzelsensillum-Elektrophysiologie als Mittel zur Messung der neuronalen Aktivität bietet – hohe räumliche und zeitliche Auflösung, ohne dass genetische Werkzeuge erforderlich sind – und die wichtigsten Einschränkungen der traditionellen Tip-Recording-Technik überwindet.
Introduction
Insekten, zu denen auch drosophilide Fliegen gehören, verfügen über ein ausgeklügeltes Geschmackssystem, das es ihnen ermöglicht, komplexe chemische Informationen aus ihrer Umgebung zu extrahieren. Dieses System ermöglicht es ihnen, die chemische Zusammensetzung verschiedener Substanzen zu erkennen und zwischen nahrhaften und schädlichen Substanzen zu unterscheiden 1,2.
Das Herzstück dieses Systems sind spezialisierte Strukturen, die als Geschmackshaare oder Sensillen bekannt sind und strategisch an verschiedenen Körperteilen angeordnet sind. Bei drosophilen Fliegen befinden sich diese Sensillen auf dem Labellum, dem Hauptgeschmacksorgan des Fliegenkopfes 1,2,3,4, sowie an den Beinen und Flügeln 1,2,5,6. Das Labellum befindet sich an der Spitze des Rüssels und enthält zwei Lappen 4,7,8. Jeder Lappen ist mit 31 Geschmackssensillen bedeckt, die als kurz, lang und intermediärkategorisiert sind 4,7,8. Diese Sensillen beherbergen jeweils 2-4 Geschmacksneuronen 1,2,9,10. Diese Geschmacksneuronen exprimieren Mitglieder von mindestens vier verschiedenen Genfamilien, nämlich dem gustatorischen Rezeptor (Gr), dem ionotropen Rezeptor (Ir), dem Taschendieb (Ppk) und den Genen des transienten Rezeptorpotentials (Trp) 1,2,11,12,13 . Diese Vielfalt an Rezeptoren und Kanälen stattet Insekten mit der Fähigkeit aus, eine breite Palette chemischer Verbindungen zu erkennen, einschließlich sowohl nichtflüchtiger als auch flüchtiger Signale 1,2,14.
Seit über 50 Jahren quantifizieren Wissenschaftler die Reaktion von Geschmacksneuronen und ihren Rezeptoren mit einer Technik namens tip recording 3,4,6,8,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24 ,25,26,27,28,
29,30,31,32,33,34,35. Diese Methode hat jedoch große Einschränkungen. Erstens kann die neuronale Aktivität nur während des Kontakts mit dem Reiz gemessen werden und nicht vor oder nach dem Kontakt. Diese Einschränkung schließt die Messung der spontanen Spike-Aktivität aus und verhindert die Messung von OFF-Reaktionen. Zweitens können nur Geschmacksstoffe getestet werden, die in wässrigen Lösungen löslich sind.
Diese Einschränkungen können durch eine selten verwendete alternative elektrophysiologische Technik namens “Base Recording” überwunden werden. Hier beschreiben wir diese Technik, die wir von einer Methode adaptiert haben, die von Marion-Poll und Kollegenverwendet wurde 24, und zeigen die entscheidenden Geschmackscodierungsmerkmale, die sie jetzt bequem messen kann14.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bei Aufzeichnungen von einigen Arten von Sensillen kann es schwierig sein, die Spikes verschiedener Neuronen zu unterscheiden. Zum Beispiel produzieren die Zuckerneuronen und mechanosensorischen Neuronen von S- und I-Sensillen Spikes mit ähnlichen Amplituden, was es schwierig macht, sie zu unterscheiden 4,14. Wir stellen fest, dass die Verwendung einer sehr scharfen Wolfram-Aufzeichnungselektrode das Feuern des mechanosensorischen Neurons reduziert, ebenso wie d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Zina Berman für die Unterstützung, Lisa Baik für ihre Kommentare zum Manuskript und anderen Mitgliedern des Carlson-Labors für die Diskussion. Diese Arbeit wurde durch das NIH-Stipendium K01 DC020145 an H.K.M.D. unterstützt; und NIH gewährt J.R.C. R01 DC02174, R01 DC04729 und R01 DC011697.
Materials
| Microscope | Olympus | BX51WI | equipped with a 50X objective (LMPLFLN 50X, Olympus) and 10X eyepieces. |
| Antivibration Table | TMC | 63-7590E | |
| motorized Micromanipulators | Harvard Apparatus and Märzhäuser Micromanipulators | Micromanipulator PM 10 Piezo Micromanipulator | |
| manual Micromanipulators | Märzhäuser Micromanipulators | MM33 Micromanipulator | |
| Magnetic stands | ENCO | Model #625-0930 | |
| Reference and recording Electrode Holder | Ockenfels Syntech GmbH | ||
| Stimulus glass capillary Holder | Ockenfels Syntech GmbH | ||
| Universal Single Ended Probe | Ockenfels Syntech GmbH | ||
| 4-CHANNEL USB ACQUISITION CONTROLLER , IDAC-4 | Ockenfels Syntech GmbH | ||
| Stimulus Controllers | Ockenfels Syntech GmbH | Stimulus Controller CS 55 | |
| Personal Computer | Dell | Vostro | Check for compatibility with digital acquisition system and software |
| Tungsten Rod | A-M Systems | Cat#716000 | |
| Aluminum Foil and/or Faraday Cage | Electromagnetic noise shielding | ||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Pipette Puller | Sutter Instrument Company | Model P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | |
| Stereomicroscope | Olympus | VMZ 1x-4x | For fly preparation |
| p200 Pipette Tips | Generic | ||
| Microloader tips | Eppendorf | E5242956003 | |
| 1 ml Syringe | Generic | ||
| Crocodile clips | |||
| Power Transformers | STACO ENERGY PRODUCTS | STACO 3PN221B | Assembled from P1000 pipette tips, flexible plastic tubing, and mesh |
| Modeling Clay | Generic | ||
| Forceps | Generic | ||
| Plastic Tubing | Saint Gobain | Tygon S3™ E-3603 | |
| Standard culture vials | Archon Scientific | Narrow 1-oz polystyrene vails, each with 10 mL of glucose medium, preloaded with cellulose acetate plugs | |
| Berberine chloride (BER) | Sigma-Aldrich | Cat# Y0001149 | |
| Denatonium benzoate (DEN) | Sigma-Aldrich | Cat# D5765 | |
| N,N-Diethyl-m- toluamide (DEET) | Sigma-Aldrich | Cat# 36542 |
References
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