Registrazione di base: una tecnica per analizzare le risposte dei neuroni del gusto in Drosophila
Summary
Un metodo di registrazione elettrofisiologica raramente utilizzato, la registrazione di base, consente l’analisi di caratteristiche della codifica del gusto che non possono essere esaminate con i metodi di registrazione convenzionali. La registrazione delle basi consente anche l’analisi delle risposte gustative a stimoli idrofobici che non possono essere studiati con metodi elettrofisiologici tradizionali.
Abstract
Gli insetti assaporano il mondo esterno attraverso i peli del gusto, o sensilla, che hanno i pori sulla punta. Quando un sensillum entra in contatto con una potenziale fonte di cibo, i composti della fonte di cibo entrano attraverso il poro e attivano i neuroni all’interno. Per oltre 50 anni, queste risposte sono state registrate utilizzando una tecnica chiamata registrazione delle mance. Tuttavia, questo metodo presenta importanti limitazioni, tra cui l’incapacità di misurare l’attività neurale prima o dopo il contatto con lo stimolo e il requisito che i tastanti siano solubili in soluzioni acquose. Descriviamo qui una tecnica che chiamiamo registrazione di base, che supera queste limitazioni. La registrazione delle basi consente di misurare l’attività dei neuroni del gusto prima, durante e dopo lo stimolo. Pertanto, consente un’analisi approfondita delle risposte OFF che si verificano dopo uno stimolo gustativo. Può essere utilizzato per studiare composti idrofobici come i feromoni a catena lunga che hanno una solubilità molto bassa in acqua. In sintesi, la registrazione di base offre i vantaggi dell’elettrofisiologia a singolo sensillum come mezzo per misurare l’attività neuronale – alta risoluzione spaziale e temporale, senza la necessità di strumenti genetici – e supera i limiti chiave della tradizionale tecnica di registrazione della punta.
Introduction
Gli insetti, comprese le mosche drosofilide, sono dotati di un sofisticato sistema di gusto che consente loro di estrarre informazioni chimiche complesse dall’ambiente circostante. Questo sistema consente loro di discernere la composizione chimica di varie sostanze, distinguendo tra quelle nutrienti e quelle dannose 1,2.
Al centro di questo sistema ci sono strutture specializzate note come peli del gusto o sensilla, posizionate strategicamente su varie parti del corpo. Nelle mosche drosofilidi, questi sensilli si trovano sul labello, che è il principale organo gustativo della testa della mosca 1,2,3,4, nonché sulle zampe e sulle ali 1,2,5,6. Il labello si trova all’estremità della proboscide e contiene due lobi 4,7,8. Ogni lobo è ricoperto da 31 sensilli gustativi classificati come corti, lunghi e intermedi 4,7,8. Questi sensilli ospitano ciascuno 2-4 neuroni gustativi 1,2,9,10. Questi neuroni del gusto esprimono membri di almeno quattro diverse famiglie di geni, vale a dire i geni del recettore gustativo (Gr), del recettore ionotropico (Ir), del borseggiatore (Ppk) e del potenziale del recettore transitorio (Trp) 1,2,11,12,13. Questa diversità di recettori e canali fornisce agli insetti la capacità di riconoscere un’ampia gamma di composti chimici, inclusi segnali non volatili e volatili 1,2,14.
Per oltre 50 anni, gli scienziati hanno quantificato la risposta dei neuroni del gusto e dei loro recettori utilizzando una tecnica chiamata registrazione della punta 3,4,6,8,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24 ,25,26,27,28,
29,30,31,32,33,34,35. Tuttavia, questo metodo presenta grosse limitazioni. In primo luogo, l’attività neurale può essere misurata solo durante il contatto con lo stimolo e non prima o dopo il contatto. Questa limitazione preclude la misurazione dell’attività di picco spontaneo e impedisce la misurazione delle risposte OFF. In secondo luogo, possono essere testati solo i sapori solubili in soluzioni acquose.
Queste limitazioni possono essere superate da una tecnica elettrofisiologica alternativa raramente utilizzata chiamata “registrazione di base”. Qui descriviamo questa tecnica, che abbiamo adattato da un metodo utilizzato da Marion-Poll e colleghi24, e mostriamo le caratteristiche cruciali della codifica del gusto che ora può comodamente misurare14.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nelle registrazioni di alcuni tipi di sensilli, può essere difficile differenziare i picchi di diversi neuroni. Ad esempio, i neuroni dello zucchero e i neuroni meccanosensoriali dei sensilli S e I producono picchi di ampiezza simile, rendendo difficile distinguerli 4,14. Troviamo che l’uso di un elettrodo di registrazione al tungsteno molto affilato riduce l’attivazione del neurone meccanosensoriale, così come il posizionamento giudizioso dell’elettrodo di reg…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Zina Berman per il supporto, Lisa Baik per i commenti sul manoscritto e altri membri del laboratorio Carlson per la discussione. Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione NIH K01 DC020145 a H.K.M.D; e NIH concede R01 DC02174, R01 DC04729 e R01 DC011697 a J.R.C.
Materials
| Microscope | Olympus | BX51WI | equipped with a 50X objective (LMPLFLN 50X, Olympus) and 10X eyepieces. |
| Antivibration Table | TMC | 63-7590E | |
| motorized Micromanipulators | Harvard Apparatus and Märzhäuser Micromanipulators | Micromanipulator PM 10 Piezo Micromanipulator | |
| manual Micromanipulators | Märzhäuser Micromanipulators | MM33 Micromanipulator | |
| Magnetic stands | ENCO | Model #625-0930 | |
| Reference and recording Electrode Holder | Ockenfels Syntech GmbH | ||
| Stimulus glass capillary Holder | Ockenfels Syntech GmbH | ||
| Universal Single Ended Probe | Ockenfels Syntech GmbH | ||
| 4-CHANNEL USB ACQUISITION CONTROLLER , IDAC-4 | Ockenfels Syntech GmbH | ||
| Stimulus Controllers | Ockenfels Syntech GmbH | Stimulus Controller CS 55 | |
| Personal Computer | Dell | Vostro | Check for compatibility with digital acquisition system and software |
| Tungsten Rod | A-M Systems | Cat#716000 | |
| Aluminum Foil and/or Faraday Cage | Electromagnetic noise shielding | ||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Pipette Puller | Sutter Instrument Company | Model P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | |
| Stereomicroscope | Olympus | VMZ 1x-4x | For fly preparation |
| p200 Pipette Tips | Generic | ||
| Microloader tips | Eppendorf | E5242956003 | |
| 1 ml Syringe | Generic | ||
| Crocodile clips | |||
| Power Transformers | STACO ENERGY PRODUCTS | STACO 3PN221B | Assembled from P1000 pipette tips, flexible plastic tubing, and mesh |
| Modeling Clay | Generic | ||
| Forceps | Generic | ||
| Plastic Tubing | Saint Gobain | Tygon S3™ E-3603 | |
| Standard culture vials | Archon Scientific | Narrow 1-oz polystyrene vails, each with 10 mL of glucose medium, preloaded with cellulose acetate plugs | |
| Berberine chloride (BER) | Sigma-Aldrich | Cat# Y0001149 | |
| Denatonium benzoate (DEN) | Sigma-Aldrich | Cat# D5765 | |
| N,N-Diethyl-m- toluamide (DEET) | Sigma-Aldrich | Cat# 36542 |
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