Base Recording: En teknik för att analysera reaktioner från smakneuroner hos Drosophila
Summary
En sällan använd metod för elektrofysiologisk registrering, basregistrering, gör det möjligt att analysera egenskaper hos smakkodning som inte kan undersökas med konventionella registreringsmetoder. Basregistrering gör det också möjligt att analysera smakreaktioner på hydrofoba stimuli som inte kan studeras med traditionella elektrofysiologiska metoder.
Abstract
Insekter smakar på den yttre världen genom smakhår, eller sensilla, som har porer i spetsarna. När en sensillum kommer i kontakt med en potentiell födokälla kommer föreningar från födokällan in genom poren och aktiverar neuroner inuti. I över 50 år har dessa svar registrerats med hjälp av en teknik som kallas spetsregistrering. Denna metod har dock stora begränsningar, inklusive oförmågan att mäta neural aktivitet före eller efter stimuluskontakt och kravet på att smakämnen ska vara lösliga i vattenlösningar. Vi beskriver här en teknik som vi kallar basinspelning, som övervinner dessa begränsningar. Basinspelning gör det möjligt att mäta smakneuronaktiviteten före, under och efter stimuleringen. Således möjliggör det omfattande analys av OFF-svar som uppstår efter en smakstimulus. Det kan användas för att studera hydrofoba föreningar såsom långkedjiga feromoner som har mycket låg löslighet i vatten. Sammanfattningsvis erbjuder basinspelning fördelarna med enkelsensillumelektrofysiologi som ett sätt att mäta neuronal aktivitet – hög rumslig och tidsmässig upplösning, utan behov av genetiska verktyg – och övervinner viktiga begränsningar i den traditionella tipsinspelningstekniken.
Introduction
Insekter, inklusive drosofilida flugor, är utrustade med ett sofistikerat smaksystem som gör det möjligt för dem att extrahera komplex kemisk information från sin omgivning. Detta system gör det möjligt för dem att urskilja den kemiska sammansättningen av olika ämnen och skilja mellan de som är näringsrika och de som är skadliga 1,2.
Kärnan i detta system är specialiserade strukturer som kallas smakhår eller sensilla, strategiskt placerade på olika kroppsdelar. Hos drosophilida flugor är dessa sensilla belägna på labellum, som är det viktigaste smakorganet för flughuvudet 1,2,3,4, samt på benen och vingarna 1,2,5,6. Labellum ligger i spetsen av snabeln och innehåller två lober 4,7,8. Varje lob är täckt med 31 smaksensilla kategoriserade som korta, långa och mellanliggande 4,7,8. Dessa sensilla varje hus 2-4 smak neuroner 1,2,9,10. Dessa smakneuroner uttrycker medlemmar av minst fyra olika genfamiljer, nämligen generna Gustatorium (Gr), Ionotropic receptor (Ir), Pickpocket (Ppk) och Transient receptor potential (Trp) gener 1,2,11,12,13 . Denna mångfald av receptorer och kanaler utrustar insekter med förmågan att känna igen ett brett spektrum av kemiska föreningar, inklusive både icke-flyktiga och flyktiga signaler 1,2,14.
I över 50 år har forskare kvantifierat svaret hos smakneuroner och deras receptorer med hjälp av en teknik som kallas spetsregistrering 3,4,6,8,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24 ,25,26,27,28,
29,30,31,32,33,34,35. Denna metod har dock stora begränsningar. För det första kan neural aktivitet endast mätas under kontakt med stimulus, och inte före eller efter kontakt. Denna begränsning utesluter mätning av spontan spikaktivitet och förhindrar mätning av OFF-svar. För det andra kan endast smakämnen som är lösliga i vattenlösningar testas.
Dessa begränsningar kan övervinnas med en sällan använd alternativ elektrofysiologisk teknik som kallas “basinspelning”. Här beskriver vi denna teknik, som vi har anpassat från en metod som används av Marion-Poll och kollegor24, och visar de avgörande smakkodningsfunktionerna som den nu bekvämt kan mäta14.
Protocol
Representative Results
Discussion
I inspelningar från vissa typer av sensilla kan det vara svårt att skilja spikarna hos olika neuroner. Till exempel producerar sockerneuronerna och mekanosensoriska neuronerna i S och I sensilla spikar med liknande amplituder, vilket gör det svårt att skilja demåt 4,14. Vi finner att användningen av en mycket vass volframinspelningselektrod minskar avfyrningen av den mekanosensoriska neuronen, liksom den kloka placeringen av inspelningselektroden. Insättni…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Zina Berman för stödet, Lisa Baik för kommentarer på manuskriptet och andra medlemmar i Carlson-laboratoriet för diskussion. Detta arbete stöddes av NIH grant K01 DC020145 till H.K.M.D; och NIH beviljar R01 DC02174, R01 DC04729 och R01 DC011697 till J.R.C.
Materials
| Microscope | Olympus | BX51WI | equipped with a 50X objective (LMPLFLN 50X, Olympus) and 10X eyepieces. |
| Antivibration Table | TMC | 63-7590E | |
| motorized Micromanipulators | Harvard Apparatus and Märzhäuser Micromanipulators | Micromanipulator PM 10 Piezo Micromanipulator | |
| manual Micromanipulators | Märzhäuser Micromanipulators | MM33 Micromanipulator | |
| Magnetic stands | ENCO | Model #625-0930 | |
| Reference and recording Electrode Holder | Ockenfels Syntech GmbH | ||
| Stimulus glass capillary Holder | Ockenfels Syntech GmbH | ||
| Universal Single Ended Probe | Ockenfels Syntech GmbH | ||
| 4-CHANNEL USB ACQUISITION CONTROLLER , IDAC-4 | Ockenfels Syntech GmbH | ||
| Stimulus Controllers | Ockenfels Syntech GmbH | Stimulus Controller CS 55 | |
| Personal Computer | Dell | Vostro | Check for compatibility with digital acquisition system and software |
| Tungsten Rod | A-M Systems | Cat#716000 | |
| Aluminum Foil and/or Faraday Cage | Electromagnetic noise shielding | ||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Pipette Puller | Sutter Instrument Company | Model P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | |
| Stereomicroscope | Olympus | VMZ 1x-4x | For fly preparation |
| p200 Pipette Tips | Generic | ||
| Microloader tips | Eppendorf | E5242956003 | |
| 1 ml Syringe | Generic | ||
| Crocodile clips | |||
| Power Transformers | STACO ENERGY PRODUCTS | STACO 3PN221B | Assembled from P1000 pipette tips, flexible plastic tubing, and mesh |
| Modeling Clay | Generic | ||
| Forceps | Generic | ||
| Plastic Tubing | Saint Gobain | Tygon S3™ E-3603 | |
| Standard culture vials | Archon Scientific | Narrow 1-oz polystyrene vails, each with 10 mL of glucose medium, preloaded with cellulose acetate plugs | |
| Berberine chloride (BER) | Sigma-Aldrich | Cat# Y0001149 | |
| Denatonium benzoate (DEN) | Sigma-Aldrich | Cat# D5765 | |
| N,N-Diethyl-m- toluamide (DEET) | Sigma-Aldrich | Cat# 36542 |
References
- Joseph, R. M., Carlson, J. R. Drosophila chemoreceptors: a molecular interface between the chemical world and the brain. Trends Genet. 31 (12), 683-695 (2015).
- Montell, C. Drosophila sensory receptors-a set of molecular Swiss Army Knives. 유전학. 217 (1), 1-34 (2021).
- Dweck, H. K. M., Carlson, J. R. Molecular logic and evolution of bitter taste in Drosophila. Curr Biol. 30 (1), 17-30 (2020).
- Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of bitter taste in Drosophila. Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).
- He, Z., Luo, Y., Shang, X., Sun, J. S., Carlson, J. R. Chemosensory sensilla of the Drosophila wing express a candidate ionotropic pheromone receptor. PLoS Biol. 17 (5), e2006619 (2019).
- Ling, F., Dahanukar, A., Weiss, L. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of taste coding in the legs of Drosophila. J Neurosci. 34 (21), 7148-7164 (2014).
- Falk, R., Bleiser-Avivi, N., Atidia, J. Labellar taste organs of Drosophila melanogaster. J Morphol. 150 (2), 327-341 (1976).
- Hiroi, M., Meunier, N., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Two antagonistic gustatory receptor neurons responding to sweet-salty and bitter taste in Drosophila. J Neurobiol. 61 (3), 333-342 (2004).
- Shanbhag, S. R., Park, S. K., Pikielny, C. W., Steinbrecht, R. A. Gustatory organs of Drosophila melanogaster: fine structure and expression of the putative odorant-binding protein PBPRP2. Cell Tissue Res. 304 (3), 423-437 (2001).
- Siddiqi, O., Rodrigues, V. Genetic analysis of a complex chemoreceptor. Basic Life Sci. 16, 347-359 (1980).
- Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science. 287 (5459), 1830-1834 (2000).
- Koh, T. W., et al. The Drosophila IR20a clade of ionotropic receptors are candidate taste and pheromone receptors. Neuron. 83 (4), 850-865 (2014).
- Sánchez-Alcañiz, J. A., et al. An expression atlas of variant ionotropic glutamate receptors identifies a molecular basis of carbonation sensing. Nat Commun. 9 (1), 4252 (2018).
- Dweck, H. K. M., Carlson, J. R. Diverse mechanisms of taste coding in Drosophila. Sci Adv. 9 (46), (2023).
- Chyb, S., Dahanukar, A., Wickens, A., Carlson, J. R. Drosophila Gr5a encodes a taste receptor tuned to trehalose. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 14526-14530 (2003).
- Dahanukar, A., Lei, Y. T., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. Two Gr genes underlie sugar reception in Drosophila. Neuron. 56 (3), 503-516 (2007).
- Delventhal, R., Carlson, J. R. Bitter taste receptors confer diverse functions to neurons. Elife. 5, e11181 (2016).
- Dweck, H. K. M., Talross, G. J. S., Luo, Y., Ebrahim, S. A. M., Carlson, J. R. Ir56b is an atypical ionotropic receptor that underlies appetitive salt response in Drosophila. Curr Biol. 32 (8), 1776-1787 (2022).
- Hiroi, M., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Differentiated response to sugars among labellar chemosensilla in Drosophila. Zoolog Sci. 19 (9), 1009-1018 (2002).
- Jeong, Y. T., et al. An odorant-binding protein required for suppression of sweet taste by bitter chemicals. Neuron. 79 (4), 725-737 (2013).
- Jiao, Y., Moon, S. J., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor required for the responses to sucrose, glucose, and maltose identified by mRNA tagging. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (35), 14110-14115 (2007).
- Jiao, Y., Moon, S. J., Wang, X., Ren, Q., Montell, C. Gr64f is required in combination with other gustatory receptors for sugar detection in Drosophila. Curr Biol. 18 (22), 1797-1801 (2008).
- Kim, S. H., et al. Drosophila TRPA1 channel mediates chemical avoidance in gustatory receptor neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8440-8445 (2010).
- Lacaille, F., et al. An inhibitory sex pheromone tastes bitter for Drosophila males. PLoS One. 2 (7), e661 (2007).
- Lee, Y., et al. Gustatory receptors required for avoiding the insecticide L-canavanine. J Neurosci. 32 (4), 1429-1435 (2012).
- Lee, Y., Kim, S. H., Montell, C. Avoiding DEET through insect gustatory receptors. Neuron. 67 (4), 555-561 (2010).
- Lee, Y., Moon, S. J., Montell, C. Multiple gustatory receptors required for the caffeine response in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (11), 4495-4500 (2009).
- Lee, Y., Moon, S. J., Wang, Y., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor required for strychnine sensation. Chem Senses. 40 (7), 525-533 (2015).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Rospars, J. P., Tanimura, T. Peripheral coding of bitter taste in Drosophila. J Neurobiol. 56 (2), 139-152 (2003).
- Moon, S. J., Köttgen, M., Jiao, Y., Xu, H., Montell, C. A taste receptor required for the caffeine response in vivo. Curr Biol. 16 (18), 1812-1817 (2006).
- Moon, S. J., Lee, Y., Jiao, Y., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor essential for aversive taste and inhibiting male-to-male courtship. Current Biology. 19, 1623-1627 (2009).
- Rimal, S., et al. Mechanism of acetic acid gustatory repulsion in Drosophila. Cell Rep. 26 (6), 1432-1442 (2019).
- Shim, J., et al. The full repertoire of Drosophila gustatory receptors for detecting an aversive compound. Nat Commun. 6, 8867 (2015).
- Xiao, S., Baik, L. S., Shang, X., Carlson, J. R. Meeting a threat of the Anthropocene: Taste avoidance of metal ions by Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (25), e2204238119 (2022).
- Zhang, Y. V., Ni, J., Montell, C. The molecular basis for attractive salt-taste coding in Drosophila. Science. 340 (6138), 1334-1338 (2013).
- Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla. J Vis Exp. (84), e51355 (2014).
- Marella, S., et al. Imaging taste responses in the fly brain reveals a functional map of taste category and behavior. Neuron. 49 (2), 285-295 (2006).
- Thorne, N., Amrein, H. Atypical expression of Drosophila gustatory receptor genes in sensory and central neurons. J Comp Neurol. 506 (4), 548-568 (2008).
- Wang, Z., Singhvi, A., Kong, P., Scott, K. Taste representations in the Drosophila brain. Cell. 117 (7), 981-991 (2004).
