Sviluppo di una sonda per microscopia a forza atomica basata su pungiglione di zanzara bio-ibrida

Summary

Indagini quantitative e controllate sui comportamenti di puntura degli insetti sono fondamentali per elaborare strategie efficaci per combattere le malattie trasmesse da vettori. In questo contesto, viene introdotto un metodo per fabbricare una sonda di microscopia a forza atomica (AFM) bio-ibrida.

Abstract

Le zanzare, note come gli animali più letali per l’uomo a causa della loro capacità di trasmettere malattie, rappresentano una sfida persistente per la salute pubblica. La strategia di prevenzione primaria attualmente in uso prevede l’uso di repellenti chimici, che spesso si rivelano inefficaci in quanto le zanzare sviluppano rapidamente resistenza. Di conseguenza, l’invenzione di nuovi metodi preventivi è fondamentale. Tale sviluppo dipende da una comprensione approfondita dei comportamenti di puntura delle zanzare, che richiede una configurazione sperimentale che riproduca accuratamente gli scenari di puntura reali con parametri di test controllabili e misurazioni quantitative. Per colmare questa lacuna, è stata progettata una sonda di microscopia a forza atomica (AFM) bio-ibrida, con un pungiglione biologico – in particolare, un labbro di zanzara – come punta. Questa sonda bio-ibrida, compatibile con i sistemi AFM standard, consente una simulazione quasi autentica dei comportamenti di penetrazione delle zanzare. Questo metodo segna un passo avanti nello studio quantitativo dei meccanismi di puntura, portando potenzialmente alla creazione di barriere efficaci contro le malattie trasmesse da vettori (VBD) e aprendo nuove strade nella lotta contro le malattie trasmesse dalle zanzare.

Introduction

L’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) ha riferito che le malattie trasmesse da vettori (VBD) rappresentano oltre il 17% di tutte le malattie infettive, che causano più di 7.000.000 di decessi all’anno a livello globale. Ad esempio, essendo l’animale più letale del mondo, le zanzare diffondono numerosi agenti patogeni, come dengue, malaria e Zika, attraverso artropodi che si nutrono di sangue, provocando 700 milioni di infezioni ogni anno^. Le esplorazioni verso lo sviluppo di misure efficaci per prevenire le VBD sono di fondamentale importanza, tra cui l’imitazione dei comportamenti di penetrazione delle zanzare per studiare i loro meccanismi di puntura e gli studi di potenziali barriere per dimostrare la loro efficacia nel prevenire la penetrazione. Una sfida chiave è quella di sviluppare approcci adeguati per eseguire tali indagini. Sono stati compiuti sforzi in letteratura, incluso lo sviluppo di aghi su microscala che assomigliano alla geometria di un pungiglione di zanzara; tuttavia, molti dei materiali utilizzati per realizzare questi microaghi (ad esempio, materiali viscoelastici², silicio (Si), vetro, ceramica³, ecc.) hanno proprietà meccaniche diverse rispetto al materiale biologico della proboscide della zanzara. I materiali ingegnerizzati possono essere fragili e soggetti a fratture e deformazioni ^3,4, mentre la proboscide della zanzara può resistere meglio alla frattura o all’instabilità⁴. Il vantaggio di avere una sonda bio-ibrida che utilizza il labbro di una zanzara invece di materiali ingegnerizzati è che può essere una rappresentazione più accurata del meccanismo di perforazione delle zanzare. Inoltre, strumenti specializzati devono essere integrati con micro aghi per eseguire studi quantitativi, come la misurazione accurata della forza⁵, che non è facilmente ottenibile con configurazioni personalizzate utilizzando microaghi ingegnerizzati.

L’approccio basato sulla microscopia a forza atomica (AFM) è promettente in quanto funziona impiegando un cantilever con una punta ultrasottile accuratamente posizionata vicino alla superficie di un campione. La punta può essere scansionata o premuta verso/dentro una superficie, subendo forze attrattive o repulsive variabili a causa delle sue interazioni con un campione⁶. Queste interazioni portano alla deflessione del cantilever, che viene tracciata dalla riflessione di un raggio laser dalla parte superiore del cantilever su un fotorilevatore⁶. L’eccezionale sensibilità al movimento del sistema consente all’AFM di condurre una vasta gamma di misurazioni, tra cui, ma non solo, la mappatura morfologica con precisione picometrica, le misurazioni della forza che vanno dai piconewton ai micronewton^{e le indagini} multifisiche complete. Ad esempio, le indentazioni AFM possono essere eseguite per valutare con precisione la risposta alla forza applicata di un campione e anche per misurare la durezza, l’elasticità e altre proprietà meccaniche di un campione accoppiandole con modelli analitici appropriati⁸. La sonda dell’AFM è più comunemente realizzata in silicio (Si) o nitruro di silicio (Si₃, N₄)⁸ con una lunghezza di 20-300 μm⁹ e un raggio di punta dell’ordine di diverse o decine di nanometri¹⁰. Il raggio della punta su scala nanometrica può essere ideale per applicazioni come l’imaging ad alta risoluzione; tuttavia, non possiede le caratteristiche dei pungiglioni biologici per gli studi che cercano di imitare i comportamenti di penetrazione in termini di rigidità, raggio, forma e rapporto d’aspetto. Ad esempio, la struttura a microaghi di una zanzara è il fascicolo, che ha un rapporto d’aspetto di ~60¹¹ (lunghezza da ~1,5 mm a 2 mm; diametro ~30 μm)¹². Mentre si può presumere che una sonda AFM convenzionale assomigli a un pungiglione biologico come un labbro, le sue proprietà e dimensioni distinte del materiale non rifletteranno la situazione reale durante un morso.

Per consentire indagini quantitative sui comportamenti di penetrazione che imitano i morsi biologici di insetti o altri animali con pungiglioni, qui viene sviluppato un processo per fabbricare cantilever AFM bio-ibridi con un pungiglione biologico come punta. Come caso di studio, è stato dimostrato con successo un cantilever AFM con la punta di un labbro di zanzara attaccato. Sfruttando le informazioni esistenti dalla letteratura sulle tipiche forze di inserzione che una zanzara usa per perforare la pelle di una vittima^12,13, questo cantilever AFM bio-ibrido può potenzialmente consentire un’imitazione quasi reale delle punture di zanzara sotto un normale AFM. Il protocollo di sfruttare i pungiglioni microbiologici per fabbricare cantilever AFM bio-ibridi può essere applicato anche allo sviluppo di altri cantilever AFM bioibridi a base di pungiglione affilato per indagini quantitative di una varietà di meccanismi di morso.

Terminologie
Uno schema di una proboscide e dei suoi componenti di interesse è mostrato nella Figura 1 e le loro definizioni sono (1) Proboscide: una parte del corpo della bocca di una zanzara che consente alla zanzara di nutrirsi, con una struttura nucleo-guscio composta dal fascicolo (nucleo) e dal labbro (guscio), (2) Labio: la copertura esterna scura e smussata di una proboscide², (3) Fascicolo: un gruppo di aghi sottili contenuti all’interno del labbro, tra cui due mascelle, due mandibole, un’ipofaringe e un labbro², (4) Ipofaringe: responsabile della secrezione di saliva nel flusso sanguigno dell’ospite², (5) Mascelle: membro seghettato che assiste nel meccanismo di alimentazione², (5) Mandibole: simili alla mascella, aiutano la zanzara nel meccanismo di alimentazione e hanno una punta acuminata², (6) Labbro: il membro principale per penetrare nella pelle di una vittima, che è molto più grande delle mascelle, delle mandibole e dell’ipofaringe. Ha anche strutture sensoriali che gli consentono di trovare vasi sanguigni e canali interni sotto la pelle², (7) Manipolatore: un gruppo con tre gradi di libertà e precisione su scala micron per il posizionamento, che consente il movimento nelle direzioni XYZ, (8) Gruppo morsetto: un morsetto in 2 parti su misura montato sul manipolatore utilizzato per bloccare il cantilever AFM senza punta durante l’esperimento.

Protocol

La specie di zanzara utilizzata per questo protocollo è una femmina adulta non infetta di Aedes aegypti (A. aegypti), ricevuta congelata e conservata in un congelatore a -20 °C. La specie è stata fornita dal NIH/NIAID Filariasis Research Reagent Resource Center per la distribuzione attraverso BEI Resources, NIAID, NIH: Aedes aegypti non infetta, ceppo Black Eye Liverpool (Frozen), NR-48920. I reagenti e le attrezzature utilizzate per lo studio sono elencati nella tabella dei material…

Representative Results

Le immagini al microscopio elettronico a scansione (SEM) della sonda AFM bio-ibrida fabbricata possono essere trovate nella Figura 7. L’estremità del labbro è stata incollata con successo alla trave a sbalzo senza punta. A causa della naturale curvatura dei pungiglioni di zanzara e del funzionamento manuale del protocollo presentato, è estremamente difficile ottenere un cantilever con una punta del pungiglione perfettamente perpendicolare al cantilever. L’angolo decentrato tra il pungigli…

Discussion

La fase 1 del protocollo ha lo scopo di pulire il campione biologico dal labbro indesiderato. Per ottenere ciò, viene praticata un’incisione sul labbro, ma non sul fascicolo, che si trova direttamente sotto il labbro (Figura 1). Poiché il fascicolo e il labbro non sono uniti insieme alla loro interfaccia (cioè, il labbro è libero di scorrere lungo il fascicolo ed è tenuto in posizione solo dal suo attacco alla testa della zanzara), l’incisione eseguita ha lo scopo di separare parte del …

Materials

5-SA-SE Straight Tapered Ultra Fine-Pointed Tweezers	Excelta	N/A	For manipulating/dissecting the proboscis.
C-4D Probe station	Everbeing Int’l Corp	N/A	Used for AFM assembly.
Tipless Tapping Mode Cantilever	NanoAndMore USA	TL-NCH	AFM cantilever used for mounting the labrum. Specs are shown here: Shape: Beam Force Constant: 42 N/m (10 – 130 N/m) Resonance Frequency: 330 kHz (204 – 497 kHz) Length: 125 µm (115 – 135 µm) Width: 30 µm (22.5 – 37.5 µm) Thickness: 4 µm ( 3 – 5 µm)
UV Expoxy	Let's resin	ALR00146	For stinger attachment.