쥐 비장 조직 형성을 조사하기 위한 Basement Membrane Matrix Encapsulated Cell Aggregation

요약

이 기사에서는 반고체 기저막 매트릭스 내에서 비장 세포를 응집하고 캡슐화하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 기저막 매트릭스 구축물은 오가노이드 발달 연구 또는 생체 내 이식 및 조직 재생 연구를 위한 3차원 배양에 사용할 수 있습니다.

초록

비장은 혈액 매개 면역 반응에 중요한 역할을 하는 면역 기관입니다. 이 조직의 해부학적 또는 기능적 손실은 심각한 혈액 감염 및 패혈증에 대한 감수성을 증가시킵니다. 비장 절편의 자가 이식은 손실된 조직을 대체하고 면역 기능을 회복하기 위해 임상적으로 사용되었습니다. 그러나 견고하고 면역학적으로 기능하는 비장 조직 재생을 유도하는 메커니즘은 완전히 설명되지 않았습니다. 여기에서 우리는 비장 조직 형성을 위한 세포 요구 사항을 조사하기 위해 반고체 매트릭스 내에서 비장 세포를 응집하고 캡슐화하는 방법을 개발하는 것을 목표로 합니다. 기저막 매트릭스 캡슐화된 세포 구조는 3차원 오가노이드의 체외 조직 배양과 생체 내 조직 형성을 직접 평가하기 위한 신장 캡슐 아래 이식 모두에 적용할 수 있습니다. 응집 및 캡슐화를 위해 입력 세포를 조작함으로써 동물 이식 모델에서 비장 조직 재생에 이식편 유래 PDGFRβ⁺MAdCAM-1^- 신생아 기질 세포가 필요하다는 것을 입증합니다.

서론

비장의 외상성 파열과 신체에 다발성 비장 결절의 출현은 비장 조직이 재생 능력을 가지고 있다는 첫 번째 징후^{중 하나였습니다 1,2}. 이후 응급 비장 절제술이 필요한 환자의 비장 조직을 보존하기 위해 비장 자가이식술이 임상에 도입되었다³. 그러나 수십 년 동안 임상 진료의 일부였음에도 불구하고 비장이 어떻게 재생되는지에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 동물 이식 모델은 비장 재생 및 면역 기능의 여러 매개변수에 대한 통찰력을 제공했습니다 ^4,5. 특히, 이식편 전처리 방법에 대한 실험적 변형을 통해 조직 재생을 세포 및 분자 수준에서 더 자세히 연구할 수 있게 되었습니다.

전체 비장 절편을 포함하는 이식은 새로운 비장 구조가 재건되기 전에 대량 괴사 단계를 거친다⁶. 이식편 괴사의 초기 단계는 이식된 조직의 대부분이 적혈구와 백혈구로 구성되어 있으며 비장 재생에 필요하지 않다는 것을 시사합니다. 이것은 쥐 신장 캡슐 아래에 이식하기 전에 비장 이식....

프로토콜

모든 동물 시술은 퀸즐랜드 대학교 동물 윤리 위원회(UQBR/079/19)에서 승인한 실험 프로토콜에 따라 수행되었습니다.

1. 조직 수집 및 기질 세포 준비

1. 0.5-1.5일 된 수컷 및/또는 암컷 BALB/c 신생아 기증자 마우스를 티슈 페이퍼에 싸서 >10분 동안 으깬 얼음 아래에 두어 저체온증을 유도하여 안락사시킵니다.
   참고: 이 프로토콜은 다양한 마우스 균주, 연령 및 동물 수에 맞게 조정할 수 있습니다.
2. 멸균 수술 기구를 준비하십시오.
3. 마우스를 오른쪽 측면 위치에 놓습니다. 80 % 에탄올로 피부를 닦고 아이리스 수술 용 가위로 1cm를 절개하여 복막 벽을 노출시킵니다.
4. 비장 위로 0.5cm를 더 절개하고 가는 집게를 사용하여 조직을 부드럽게 들어 올립니다. 수술용 가위를 사용하여 혈관을 자르고 조직을 절제합니다. 조직을 얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수(PBS)가 포함된 페트리 접시에 옮깁니다. 비장에 붙어 있는 남아 있는 결합 조직을 제거합니다.
   알림: 실체현미경은 수술 기구를 조작하는 데 필요한 미세 운동 움직임을 지원할 수 있습니다.
5. 전체 조직을 해리하려면 신생아 비장(10개 이하의 웅덩이)을 거....

결과

세포 응집은 세포 간 접촉 및 신호 전달을 촉진하는 데 중요합니다. 기저막 매트릭스 내부에 세포 응집체를 감싸는 것은 체외 조직 오가노이드 형성을 위한 3차원 배양을 모두 지원하고 이식편 이식을 위해 신장 캡슐로 세포를 기계적으로 전달하는 것을 용이하게 했습니다. 이러한 구조를 확립하기 위해, 기저막 매트릭스는 먼저 얼음처럼 차가운 조건에서 유체 상태로 유지되었습니다. 세포 응집은 이후에 위에 집중된 세포 현탁액을 층상하고 원심력을 사용하여 고밀도 매트릭스를 통해 세포를 밀어냄으로써 달성되었습니다. 원심분리 속도(200-2000 x g)의 최적화는 중간층 셀 포지셔닝(그림 1A)을 달성하는 데 필요했으며, 이는 셀 수에 따라 달라집니다. 더 높은 원심력(>500 x g)은 세포를 피펫의 맨 끝까지 밀어냈으며(그림 1B), 유연한 실험실 필름 덮개를 제거하는 동안 손실될 .......

토론

반고체 배지 내부의 신생아 비장 세포의 응집은 비장 구조를 생성하기 위한 실행 가능한 방법을 나타냅니다. 유사한 기저막 매트릭스 기반 프로토콜이 3차원 비장 배양을 시작하기 위해 사용되어^{왔다 10}. 여기에서 우리는 비장 구조가 in vitro 오가노이드 배양 시스템뿐만 아니라 in vivo 이식 모델에도 동일하게 적용된다는 것을 보여줍니다. 참고로, 체외 배양 비장 오가노이드의 이식은 아직 테스트되지 않았지만 전체 또는 부분 비장 조직 재생 능력을 결정하는 것이 흥미로울 것입니다. 이 프로토콜은 또한 이전의 비장 이식 연구에서 기술된 세포 응집 기술을 계승한다⁸. 이 연구에는 콜라겐 시트 위에 세포 응집체를 로딩한 다음 신장 캡슐 아래에 이식하는 것이 포함되었습니다. 기저막 매트릭스 내부의 세포 응집체 봉입은 이식편 방향 측면에서 뚜렷한 이점을 제공하며, 콜라겐 시트 면이 아래로 향하게 하는 것과.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
96 웰 폴리 프로필렌 1.2 mL 클러스터 튜브	코닝	CLS4401	14 ml 원뿔형 튜브
B-메르 캅토 에탄올	Gibco	21985023	재고 55 mM, 50 uM
콜라겐 분해 효소 D	Roche	11088858001
콜라겐 분해 효소 IV	시그마 -알드리치	C5138	Clostridium histolyticum
Deoxyribonuclease I (DNase I)	그마-알드리치	D4513	소의 췌장에서 추출한 디옥시리보뉴클레아제 I, 유형 II-S, 동결건조 분말, 단백질 ≥ 80 %, ≥ 2,000 units/mg 단백질
Dulbecco' 의 변형된 독수리' s 매체 (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796	4500 mg/L 포도당, L-글루타민 및 중탄산나트륨, 피루브산나트륨 제외, 액체. 멸균 여과.
Dulbecco의 인산염 완충 식염수 (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537	염화칼슘 및 염화마그네슘없이, 멸균 여과
된 Eclipse 200 μ l 피펫 팁	Labcon	1030-260-000	Bevel Point
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	26140-079	Lot# 1382243
GlutaMAX	Gibco	35050061	Stock 100X, 1X
Matrigel	Corning	354263	Matrigel matrix basement membrane High Concentration, Lot# 7330186
MEM Non-essential Amino Acids	Gibco	11140076	재고 100X, 1X
페니실린/스트렙토마이신	Gibco	15140122	재고 10,000 단위/ml 페니실린, 10,000 ug/ml 스트렙토마이신
가역 세포 여과기	STEMCELL Technologies	27216	70 μ m
링 핀셋	NAPOX	A-26	링 크기: 3mm
락 억제제(Y-27632)	MedChemExpres	HY-10071
Thermofisher Heraeus Megafuge 40R 원심분리기	Thermofisher		가속 및 감속 속도는 8로 설정되었습니다
초미세 핀셋	EMS	78340-51S	스타일 51S. 항자성/내산성 SA 저탄소 오스테나이트계 강철 핀셋은 부식에 강합니다. 눈부심 방지 새틴 마감.
Vicryl 5/0 봉합사 Ligapak 릴	Ethicon	J283G
Wiretrol II 긴 와이어 플런저	Drummond	5-000-2002-L	스테인레스 스틸 플런저, 25 & 50 & mu; L/WRTL II, 롱
상처 클립 애플리어	MikRon	427630
상처 클립	MikRon	427631	9mm

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