여기에서는 저산소증 민감성 키메라 항원 수용체(CAR)-T 세포의 생성 및 기능 검증을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 저산소증 민감성 CAR-T 세포의 렌티바이러스 기반 생성과 저산소증 의존성 CAR 발현 및 선택적 세포 독성의 검증을 포함한 특성 분석을 제시합니다.
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방법 논문
저산소증 민감성 키메라 항원 수용체-T 세포의 생성 및 기능 검증
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
광범위한 연구를 통해 혈액 악성 종양 치료에 있어 키메라 항원 수용체 T(CAR-T) 세포 치료의 가능성을 입증했습니다. 그러나 고형 종양의 치료는 여전히 어려운 과제이며, 이는 CAR-T 세포가 표적 항원을 발현하는 정상 세포를 공격할 때 발생하는 안전성 문제에서 알 수 있습니다. 연구자들은 CAR-T 세포 치료제의 종양 선택성을 향상시키기 위해 다양한 접근법을 탐구해 왔습니다. 이와 관련된 대표적인 전략 중 하나는 저산소증 민감성 CAR-T 세포의 구축으로, 이 세포는 산소 의존적 분해 도메인을 CAR 부분에 융합하여 설계되고 저산소 환경인 종양 미세환경(TME)에서만 높은 CAR 발현을 달성하도록 전략화됩니다. 이 논문은 이동식 인큐베이터 챔버에 의해 설정된 다양한 산소 농도에 대한 CAR 발현 및 사멸 능력의 변화를 분석하는 방법을 포함하여 이러한 CAR-T 세포의 생성 및 기능적 특성화를 위한 프로토콜을 제시합니다. 구축된 CAR-T 세포는 산소에 민감한 방식으로 CAR 발현 및 세포 독성을 입증할 것으로 예상되며, 이를 통해 선택적 활성화를 위해 저산소 TME와 정상 정상 조직을 구별할 수 있는 능력을 지원할 수 있습니다.
서론
키메라 항원 수용체 T 세포(CAR-T) 치료는 암 치료에서 중요한 돌파구를 제시했습니다. 2017년 미국 식품의약국(FDA)이 진행성/저항성 림프종 및 급성 림프모구성 백혈병 치료를 위한 최초의 CAR-T 치료제를 승인한 이래 전 세계적으로 CD19 또는 B세포 성숙 항원(BCMA)을 표적으로 하는 CAR-T 치료제 1,2,3,10개가 승인을 받았다4. 그러나 광범위한 연구에도 불구하고 혈액 악성 종양 치료에서 CAR-T 요법의 놀라운 효능을 재현하는 것은 고형 종양에 적용하는 데 여전히 어려운 과제로 남아 있습니다 5,6,7,8.
면역억제 종양미세환경(TME)은 고형 종양 환경에서 CAR-T의 낮은 효능에 ....
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프로토콜
이 연구에서는 HER2(유전자 ID: 2064)를 표적으로 하는 저산소증 민감성 CAR인 HER2-BBz-ODD를 일반 CAR2-BBz와 비교했습니다. 두 CAR의 개략도는 그림 1A에 나와 있으며, 이는 HER2-BBz-ODD가 ODD 시퀀스를 CD3ξ의 C-터미널에 추가하여 HER2-BBz에서 파생됨을 보여줍니다. 두 CAR을 발현하는 렌티바이러스 벡터의 구축과 293T 세포 transfection에 의한 해당 렌티바이러스의 생성은 이전에 설명되었습니다31.
1. 렌티바이러스 감염에 의한 저산소증 민감성 CAR-T 세포 생성
- 냉동 보존된 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 수조에서 37°C에서 빠르게 해동합니다. 해동된 PBMC를 400IU의 IL-2, 5ng/mL IL-7 및 10ng/mL IL-15(인간 T 세포 성장 배지, 이후 TGM 이라고 함)가 보충된 9mL의 무혈청 림프구 배양 배지가 들어 있는 15mL 튜브에 넣습니다.
- 세포 계수를 위해 부분 표본을 채취한 후 튜브를 300× g 에서 ....
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결과
HIF-1α의 ODD 도메인을 CAR 부분에 융합하는 것은 저산소증에 민감한 CAR을 생성하기 위한 주요 전략입니다. 이 연구에서 분석된 저산소증 민감성 HER2 표적 CAR인 HER2-BBz-ODD는 ODD 염기서열을 기존 HER2-BBz에 통합하여 이 전략을 사용하여 구성되었습니다(그림 1A). 이 연구에서는 렌티바이러스 형질도입을 사용하여 HER2-BBz-ODD CAR 또는 HER2-BBz CAR을 발현한 후 인간 PBMC와 Jurkat T 세포의 두 가지 세포 유형에서 산소 민감도를 조사했습니다.
첫 번째 검사는 저산소 조건과 정상 산소 조건에서의 CAR 발현으로, 유세포 분석에 의한 CAR 형질도입 PBMC 유래 T 세포와 웨스턴 블로팅에 의한 CAR 형질도입 Jurkat T 세포 모두에서 수행되었습니다. CAR 형질도입된 PBMC 유래 T 세포의 설정에서, HER2-BBz-ODD CAR은 CAR 양성 세포의 비율과 .......
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토론
안전성 문제는 모든 CAR-T 세포 치료제가 임상적으로 사용되기 위해 반드시 해결해야 하는 중요한 문제입니다. 종양 세포 또는 TME의 고유한 특성을 활용하는 것이 주요 연구 방향이 되었으며, 종양 조직을 선택적으로 표적으로 하는 CAR-T 세포 개발에 중점을 두고 있습니다. 저산소증에 민감한 CAR-T를 설계하는 것은 이 방향에서 매력적인 전략이며, 이 연구에서 제시된 CAR 부분을 자연적으로 발생하는 저산소증 감지 ODD 단백질 도메인과 융합하는 방법을 포함하여 여러 가지 접근 방식이 모색되고 있습니다. 대안적인 접근법은 CAR 발현을 유도하는 데 일반적으로 사용되는 구성적 프로모터를 이전 연구에서 가능성을 보여준 저산소증 반응 요소(HRE)로 대체하는 것입니다. HRE와 ODD 요소(보다 엄격한 발현 제어를 제공하는 와일드 타입 또는 엔지니어링 버전)를 결합하는 것이 저산소증 유발 CAR을 위한 최적의 설계를 나타낸다고 믿어집니다.
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공개 사항
저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 중국 국가 중점 연구 개발 프로그램(2016YFC1303402), 국가 주요 전염병 메가프로젝트(2017ZX10202102, 2017ZX10304402-002-007) 및 상하이시 위생건강위원회 일반 프로그램(201740194)의 보조금으로 지원되었습니다.
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참고문헌
- Boardman, A. P., Salles, G. CAR T-cell therapy in large B cell lymphoma. Hematol Oncol. 41 (S1), 112-118 (2023).
- Chen, Y. -J., Abila, B., Mostafa Kamel, Y. CAR-T: What is next. Cancers. 15 (3), 663(2023).
- Barsan, V., et al.
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