미세전극을 사용한 3차원 위장 오가노이드의 루미날 pH 프로파일링

요약

본 프로토콜은 내강 내 생리학의 시공간 특성 분석을 위해 미세전극을 사용하는 인체 조직 유래 위 오가노이드의 pH 측정에 대해 설명합니다.

초록

위장관 오가노이드 모델의 최적화와 상세한 특성 분석을 위해서는 발광 환경을 분석하기 위한 고급 방법이 필요합니다. 이 논문은 미세조작기 제어 미세전극을 통해 3D 인간 위 오가노이드의 루미나 내에서 pH를 정밀하게 측정하기 위한 재현성이 높은 방법을 제시합니다. pH 미세전극은 상업적으로 이용 가능하며 직경이 25μm인 비스듬한 유리 팁으로 구성됩니다. 측정을 위해 pH 미세전극은 Matrigel에 현탁된 오가노이드(>200μm)의 루멘으로 이동하고, 기준 전극은 배양 플레이트의 주변 매체에 잠겨 있습니다.

이러한 미세 전극을 사용하여 인간 위체에서 유래한 오가노이드를 프로파일링함으로써 루미날 pH가 ~7.7 ± 0.037로 각 배양유 내에서 비교적 일관되며 최소 15분 동안 연속 측정을 얻을 수 있음을 입증합니다. 일부 대형 오가노이드에서는 측정 결과 상피 표면과 내강 사이의 pH 구배가 나타났으며, 이는 오가노이드의 pH 측정이 높은 공간 분해능으로 달성될 수 있음을 시사합니다. 이전 연구에서는 미세전극을 사용하여 오가노이드의 발광 산소 농도를 측정하는 데 성공했으며, 이는 오가노이드 분석을 위한 이 방법의 다양성을 입증했습니다. 요약하면, 이 프로토콜은 3D 오가노이드 내 복잡한 발광 공간의 기능적 특성화를 위한 중요한 도구를 설명합니다.

서론

줄기 세포에서 유래한 오가노이드(organoid)는 인간 생리학을 연구하는 우리의 능력에 혁명을 일으켰으며, 규제 환경에서도 동물 모델을 대체하기 시작했습니다¹. 2009년 Sato et al.이 장내 오가노이드를 처음 설명한 이후 오가노이드 기술은 엄청난 인기를 얻었습니다². 많은 연구에서 오가노이드 모델의 세포 구성과 기능을 매우 상세하게 특성화했습니다 3,4,5,6. 그러나, 이러한 3D 다세포 구조의 발광 공간은 대체로 정의되지 않은 채로 남아 있다 ^7,8. 내강(元腺)은 점막 조직에서 유래한 오가노이드의 중심 구멍으로, 분극화된 상피 세포의 정점 부분으로 둘러싸여 있습니다. 세포 분비와 흡수는 주로 정점 상피 표면에서 발생하기 때문에 오가노이드의 발광 미세환경은 이러한 중요한 생리학적 과정에 의해 제어됩니다. 현재 사용되는 오가노이드 모델은 세포 신호 전달 패턴, 전반....

프로토콜

이 프로토콜에는 고유한 내강이 있고 인공 세포외 기질(ECM, 예: Matrigel)에 내장된 직경이 최소 200μm인 3D 오가노이드가 필요합니다. 오가노이드 유도를 위한 인체 위 조직은 몬태나 주립대학교 기관 검토 위원회(Institutional Review Board)의 승인과 Bozeman Health(프로토콜 # 2023-48-FCR, D.B.)에서 상부 내시경을 받는 환자의 정보에 입각한 동의를 얻어 획득했으며, 미국 국립질병연구교환지(National Disease Research Interchange, 프로토콜 #DB062615-EX)에서 면제된 위 전체 또는 소매 절제술 검체로 획득했습니다. 본 연구에 사용된 오가노이드 라인 및 통로 번호에 대한 정보는 표 1에 제공되었으며, 매체 조성은 표 2에 기재되어 있다. 위장관 오가노이드 라인의 생성 및 유지를 위해 이전에 발표된 프로토콜 ^6,26,27을 참조하십시오.

1. pH 프로파일링을 위한 인간 위 오가노이드 준비

결과

위산 분비는 인간의 위장에서 중요한 기능을 합니다. 그러나 오가노이드에서 산 분비를 어느 정도까지 모델링할 수 있는지는 여전히 논쟁의 여지가 있습니다 6,32,33,34. 따라서 우리는 위 오가노이드의 산 생성을 정확하게 측정하기 위해 위에서 설명한 프로토콜을 개발했습니다. 특히, 표준 팽창 조건에서 배양한 자극되지 않은 성체 줄기세포 유래 오가노이드를 여러 번 통과시켰으며, 이로 인해 두정세포 손실이 발생했습니다³⁵. 따라서, 산 분비 두정 세포의 존재와 활성 산 방출은 우리의 모델 시스템에서 예상되지 않았습니다.

실험을 위해 직경이 200μm에서 1,000μm 사이인 오가노이드를 유리 바닥 접시에 파종했습니.......

토론

오가노이드의 발광 공간에 대한 제한된 접근은 이 미세환경의 생리학적 역학에 대한 우리의 이해를 심각하게 제한했습니다. 루미날 생리학의 기능 분석을 위한 신뢰할 수 있는 도구는 생리학, 약리학 및 질병 연구를 위한 체외 모델처럼 오가노이드를 활용할 수 있는 능력을 확장할 것입니다. 오가노이드는 조정 가능성이 높고 생리학적으로 관련성이 높은 모델로, 인간 집단 내에서 유전적 다양성을 복제할 수 있는 잠재력이 있습니다. 오가노이드 내강 내부의 pH 측정을 위한 기존 방법은 pH에 민감한 염료 또는 나노입자를 사용했으며, 이러한 방법은 종종 형광 현미경 또는 분광법 16,17,37과 결합되어야 합니다. 설명된 마이크로센서 기반 프로파일링 방법은 새로운 공간 정밀도로 위장 오가노이드의 내강 내 pH를 측정하기 위한 새로운 경로를 제공합니다. 당사의 분석법은.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
3 m KCl	Unisense
5 mL Wobble-not Serological Pipet, 개별 포장, 종이/플라스틱, 백, Sterile	CellTreat	229091B
10 mL Wobble-not Serological Pipet, 개별 포장, 종이/플라스틱, 백, Sterile	CellTreat	229092B
15 mL 원심분리기 튜브 - 폼 랙, Sterile	CellTreat	229412
24웰 조직 배양 플레이트, 멸균	CellTreat	229124
25 mL 워블-비혈청학적 피펫, 개별 포장, 종이/플라스틱, 백, 멸균	CellTreat	229093B
35 mm 접시 | No. 1.5 커버슬립 | 20mm 유리 직경 | 코팅되지 않은	MatTek	P35G-1.5-20-C
50 mL 원심분리기 튜브 - 폼 랙, 멸균	CellTreat	229422
70% 에탄올	BP82031GAL	BP82031GAL
70 μ m 세포 여과기, 개별 포장, 멸균	CellTreat	229483
1,000 &마이크로; L 확장 길이 저보유 피펫 팁, 랙형, 멸균	CellTreat	229037
Amphotericin B (Fungizone) 솔루션	HyClone Laboratories, Inc	SV30078.01
Biosafety Cabinet	Nuaire	NU-425-600	Class II Type A/B3
소 혈청 알부민	Fisher 생물 시약	BP1605-100
세포 회수 용액	Corning		354253 세포 해리 용액
DMEM/F-12 (Advanced DMEM)	Gibco	12-491-015
Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM)	Fisher Scientific	15017CV
태아 소 혈청	HyClone Laboratories, Inc	SH30088
G418 황산염	Corning	30-234-CR
겐타마이신 황산염	IBI Scientific	IB02030
HEPES, Free Acid	Cytiva	SH30237.01
HP Pavillion 2-in-1 14" 노트북 Intel Core i3	HP	M03840-001
염산	Fisher Scientific	A144C-212
인큐베이터	Fisher Scientific	11676604
iPhone 12 카메라	Apple
L-glutamine	Cytiva	SH3003401
대형 Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes 섬세한 작업 와이퍼, 1-플라이	Fisher Scientific	34133
M 205 FA 실체 현미경	Leica
Matrigel 멤브레인 매트릭스	354234 Corning	CB-40234
MC-1 UniMotor 컨트롤러	Unisense
메틸 레드
MM33 Micromanipulator	Marzhauser Wetzlar	61-42-113-0000	오른손잡이
MS-15 전동 스테이지	Unisense
Nanoject-II	Drummond	3-000-204	나노리터 자동주사기
페니실린/스트렙토마이신(10,000 U/mL)	Gibco	15-140-148
pH 미세전극	Unisense	50-109158, 25-203452, 25-205272, 25-111626, 25-109160	SensorTrace 소프트웨어는 Apple 컴퓨터와 호환되지 않습니다
참조 전극	Unisense	REF-RM-001652	SensorTrace 소프트웨어는 다음과 호환되지 않습니다. 애플 컴퓨터
SB 431542	Tocris Bioscience	16-141-0
스마트폰 카메라 어댑터	Gosky
사양 실험실 스탠드 LS	Unisense	LS-009238
트립신-EDTA 0.025%, 페놀 레드	Gibco	25-200-056
UniAmp	Unisense	11632
United Biosystems Inc  MINI CELL SCRAPERS 200/PK	Fisher	MCS-200
Y-27632 dihydrochloride	Tocris Bioscience	12-541-0
µ 센서 교정 키트	Unisense/ Mettler Toledo	51-305-070, 51-302-069	pH 4.01 및 9.21, 20 mL 패킷

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