हम डीएनए लेपित सोने गोलियों की तैयारी के लिए एक विधि का वर्णन है और ऐसी गोलियों के उपयोग को biolistically सुसंस्कृत hippocampal स्लाइस में न्यूरॉन्स transfect प्रदर्शित.
Biolistic अभिकर्मक उच्च वेग डीएनए लेपित कणों के साथ ऊतक बौछार से कोशिकाओं transfecting के एक भौतिक साधन है. हम चूहे hippocampal स्लाइस के biolistic अभिकर्मक के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, डीएनए लेपित गोलियों की प्रारंभिक तैयारी से organotypic टुकड़ा एक जीन बंदूक का इस्तेमाल संस्कृतियों के अंतिम शूटिंग. जीन बंदूक अभिकर्मक transfecting न्यूरॉन्स के एक कुशल और आसान साधन है और fluorescently ऊतक टुकड़ा में एक कोशिकाओं के छोटे सबसेट लेबलिंग के लिए विशेष रूप से उपयोगी है. इस वीडियो में, हम पहले कोट डीएनए के साथ सोने के कणों के लिए आवश्यक कदम रूपरेखा. हम अगले प्रदर्शन कैसे सोने / डीएनए गोलियों के साथ प्लास्टिक टयूबिंग के अंदर लाइन के लिए, और कैसे इस टयूबिंग कटौती करने के लिए जीन बंदूक में लोड करने के लिए प्लास्टिक कारतूस प्राप्त. अंत में, हम चूहे hippocampal टुकड़ा संस्कृतियों के biolistic अभिकर्मक प्रदर्शन, जैव रेड से निपटने का प्रदर्शन जीन बंदूक Helios, और मुसीबत शूटिंग सलाह की पेशकश करने के लिए स्वस्थ और बेहतर ट्रांसफ़ेक्ट ऊतक स्लाइस प्राप्त.
Biolistic अभिकर्मक ऊतक रहने के उच्च वेग डीएनए लेपित सोने के कणों के साथ बमबारी के माध्यम से कोशिकाओं transfecting के एक भौतिक साधन है. कण मध्यस्थता जीन स्थानांतरण में, सामान्य ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में परिणाम जब बुलेट नाभिक में आराम आता है. जबकि कई अलग अलग अभिकर्मक तरीकों मौजूद हैं, microinjection, lipofection, कैल्शियम फॉस्फेट अभिकर्मक electroporation, और वायरल अभिकर्मक के रूप में, biolistic अभिकर्मक एक कम श्रम गहन, कोशिकाओं है कि आसानी से इन अन्य तरीकों का उपयोग नहीं ट्रांसफ़ेक्ट हैं transfecting के लिए और कुशल वैकल्पिक पेशकश कर सकते हैं. वास्तव में, यह पहली बार पौधों में जीन स्थानांतरण के लिए एक तकनीक के रूप में विकसित किया गया था के बाद सेल की दीवार की उपस्थिति अभिकर्मक मुश्किल preexisting 1 विधियों का उपयोग. इसी तरह, biolistics तंत्रिका जीव विज्ञान के क्षेत्र में लोकप्रियता हासिल की है के बाद के बाद mitotic न्यूरॉन्स 2,3 transfect बेहद मुश्किल हैं . विशेष रूप में, यह व्यापक रूप से सिद्धांत तकनीक बरकरार मस्तिष्क स्लाइसें में एकल न्यूरॉन्स के ठीक आकारिकी का आकलन करने के उद्देश्य से प्रयोगों में इस्तेमाल किया जा के रूप में मान्यता प्राप्त है. यहाँ वर्णित तरीकों कैसे सुसंस्कृत मस्तिष्क स्लाइसें के biolistic अभिकर्मक प्रदर्शन करने के लिए एक जीन बंदूक आयोजित हाथ (जीन Helios गन प्रणाली, जैव रेड) का उपयोग कर के एक विस्तृत और व्यापक विवरण प्रदान करते हैं.
Biolistic अभिकर्मक टुकड़ा संस्कृति में न्यूरॉन्स transfecting के लिए पसंदीदा तरीका बन गया है क्योंकि यह मस्तिष्क टुकड़ा भर में कोशिकाओं का एक विरल संख्या के अभिकर्मक की अनुमति देता है. इस तरह, व्यक्तिगत न्यूरॉन्स अलगाव में जांच की जा सकती है. के बाद से इस तकनीक का विशेष रूप से अच्छी तरह से मस्तिष्क टुकड़ा में न्यूरॉन्स transfecting के लिए अनुकूल है, यह अक्सर दो photon माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन के रूप में प्रयोग किया जाता है fluorescently लेबल प्रकाश बिखरने 4 ऊतक के भीतर गहरे कोशिकाओं के 2- photon उत्तेजना सक्षम बनाता है दृश्य के बाद से. दरअसल इस वीडियो भर में एकल पिरामिड प्रस्तुत न्यूरॉन्स के उच्च बढ़ाई छवियों एक कस्टम बनाया लेजर 2-photon खुर्दबीन स्कैनिंग का उपयोग कर कब्जा कर लिया गया. निष्कर्ष biolistic अभिकर्मक में चारों ओर की कोशिकाओं के एक उच्च घनत्व के संदर्भ के भीतर व्यक्ति की कोशिकाओं transfecting का एक कारगर साधन है, और fluorescently neuronal टुकड़ा संस्कृति में व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की लेबलिंग के लिए इस तरह के रूप में अत्यंत उपयोगी साबित हो गया है.
हम पूरे hippocampal इस वीडियो में प्रस्तुत स्लाइस की कम बढ़ाई छवियों को प्राप्त करने के साथ मदद के लिए मार्क Lucanic और चेंग Hwai – जोंग धन्यवाद देना चाहूंगा. हम भी करने के लिए वीडियो के साथ पाठ के साथ सहायता के लिए सारा Parrish धन्यवाद देना चाहूंगा.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
1.6um gold particles (microcarrier) | 0.25g | Bio-Rad | 1652264 | |
1M CaCl2 | Fluka | 21115 | ||
100% EtOH | 1pint | Gold shield | ||
Cartridge Tubing | Bio-Rad | 1652412 | ||
Scintillation vials | 20ml, 500/case | VWR | 66021-668 | |
Dessication pellets | “Dricap” | MTI (800-445-9890) | ||
Water bath sonicator | model 50T | VWR | ||
Cartridge holder | pack of 5 | Bio-Rad | 1652426 | |
Barrel liner | pack of 5 | Bio-Rad | 1652417 | |
Diffuser screen | pack of 5 | Bio-Rad | 1652475 | |
O-ring | 75 Viton, Size 007, Qty, 100 | McMaster-Carr | ||
Screen (mesh) | McMaster-Carr | 144258 | ||
PVP | 20mg/ml in EtOH | Bio-Rad | Comes with tubing from biorad | |
Tubing prep station | Bio-Rad | 1652418 | ||
Tubing cutter | Bio-Rad | 1652422 | ||
Helios Gene-Gun | Bio-Rad | 1652411 | ||
Gene gun hose | Bio-Rad | Comes with Gene-Gun | ||
Spermidine | 5g | Sigma | s-0266 |