우리는 DNA 코팅 황금 총알을 준비하는 방법을 설명하고 biolistically 교양 hippocampal 조각의 뉴런을 transfect 그러한 총알의 사용을 보여줍니다.
Biolistic transfection은 고속 DNA 코팅 입자와 조직을 bombarding하여 세포를 transfecting의 물리적인 수단입니다. 우리는 DNA 코팅 총알의 초기 준비에서 유전자 총을 사용하여 organotypic 슬라이스 문화의 마지막 촬영에, 쥐 hippocampal 조각의 biolistic transfection에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 유전자 총 transfection은 뉴런을 transfecting의 효율적이고 쉬운 방법이며 찬란 조직 통에 세포의 작은 하위 집합을 라벨에 특히 유용합니다. 이 비디오에서는, 우리는 먼저 DNA와 코팅 골드 입자하는 데 필요한 단계를 설명합니다. 우리는 옆에있는 골드 / DNA 총알과 플라스틱 튜브의 내부를 선하는 방법을 보여줍니다 및 유전자 총에 로딩을위한 플라스틱 카트리지를 얻으려면이 튜브를 잘라하는 방법에 대해 설명합니다. 마지막으로, 우리는 생명 래드 취급을 보여주는 것은 유전자 총을 편, 그리고 건강하고 최적의 transfected 조직 조각을 얻기 위해 문제 해결에 대한 조언을 제공, 쥐 hippocampal 슬라이스 문화 biolistic transfection을 수행합니다.
Biolistic transfection은 고속 DNA 코팅 골드 입자 살아있는 조직의 폭격을 통해 세포를 transfecting의 물리적인 수단입니다. 총알이 핵의 나머지에 관해서는 입자 매개 유전자 전달에는 일반적으로 transfected 세포의 결과. 여러 transfection 방법이 존재하지만, 같은 microinjection, lipofection, 칼슘 인산염 transfection, electroporation 및 바이러스성 transfection으로 biolistic transfection은 쉽게 이러한 다른 방법을 사용하여 transfected되지 않은 세포를 transfecting위한 집중 적은 노동,하고 효율적인 대안을 제공할 수 있습니다. 세포 벽의 존재는 전부터 방법 1을 사용 transfection이 어려운 만든 이후 사실, 처음 식물의 유전자 전달을위한 기술로 개발되었습니다. 포스트 mitotic의 뉴런은 2,3를 transfect하는 악명 어려운되므로 마찬가지로, biolistics는 신경 생물학 분야에서 인기를 얻고있다. 특히, 그것은 널리 그대로 뇌 조각의 단일 뉴런의 벌금 형태를 평가하기위한 실험에 사용할 수있는 주요 기술로 인식되고 있습니다. 방법은 유전자 총을 개최 손 (; 바이오 래드 편 진 건 시스템)을 사용하여 양식 뇌 조각의 biolistic transfection을 수행하는 방법에 대한 상세하고 포괄적인 설명을 제공합니다 여기에서 설명한.
그것은 뇌 슬라이스에 걸쳐 세포의 스파스 번호 transfection을 허용하기 때문에 Biolistic transfection은 슬라이스 문화에 신경을 transfecting에 대한 기본 방법이되었다. 이러한 방법으로 각각의 뉴런은 격리 검사하실 수 있습니다. 이 기법은 특히 뇌 슬라이스의 뉴런을 transfecting 적합되기 때문에, 그것은 종종 광 산란 조직 네 안에 깊은 찬란 분류 세포의 2 광자 여기있게 시각화 이후, 2 광자 현미경과 함께 사용됩니다. 사실이 동영상을 통해 제공 하나 피라미드 뉴런의 높은 배율 이미지는 사용자 지정 기본 2 – 광자 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 점령했다. 결론 biolistic transfection 주변 세포가 높은 밀도의 컨텍스트 내에서 개별 세포를 transfecting의 효율적인 수단이며, 같은 찬란의 연결을 슬라이스 문화에서 개별 뉴런을 라벨에 대한 매우 유용한 입증되었습니다.
우리는이 비디오에 제시된 전체 hippocampal 조각의 낮은 배율 이미지를 인수와 관련하여 도움이 마크 Lucanic 및 Hwai – 김정일 쳉 감사드립니다. 우리는 또한 영상과 함께 텍스트로 은닉 죄로 사라 패리 감사하고 싶습니다.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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1.6um gold particles (microcarrier) | 0.25g | Bio-Rad | 1652264 | |
1M CaCl2 | Fluka | 21115 | ||
100% EtOH | 1pint | Gold shield | ||
Cartridge Tubing | Bio-Rad | 1652412 | ||
Scintillation vials | 20ml, 500/case | VWR | 66021-668 | |
Dessication pellets | “Dricap” | MTI (800-445-9890) | ||
Water bath sonicator | model 50T | VWR | ||
Cartridge holder | pack of 5 | Bio-Rad | 1652426 | |
Barrel liner | pack of 5 | Bio-Rad | 1652417 | |
Diffuser screen | pack of 5 | Bio-Rad | 1652475 | |
O-ring | 75 Viton, Size 007, Qty, 100 | McMaster-Carr | ||
Screen (mesh) | McMaster-Carr | 144258 | ||
PVP | 20mg/ml in EtOH | Bio-Rad | Comes with tubing from biorad | |
Tubing prep station | Bio-Rad | 1652418 | ||
Tubing cutter | Bio-Rad | 1652422 | ||
Helios Gene-Gun | Bio-Rad | 1652411 | ||
Gene gun hose | Bio-Rad | Comes with Gene-Gun | ||
Spermidine | 5g | Sigma | s-0266 |