Etichettatura Cellule staminali con le tinture fluorescenti per la rilevazione non invasiva con Optical Imaging
Summary
Questo video mostra le tecniche per l'etichettatura delle cellule staminali embrionali umane e cellule staminali mesenchimali con coloranti fluorescenti. Questa tecnica può essere utilizzata per un monitoraggio in vivo di cellule staminali trapiantate con imaging ottico e per le correlazioni istopatologiche con microscopia a fluorescenza.
Abstract
L'imaging ottico (OI) è uno strumento facile, veloce ed economico per il monitoraggio in vivo di nuove terapie basate sulle cellule staminali. La tecnica si basa sulla etichettatura ex vivo di cellule staminali con un colorante fluorescente, a seguito di iniezione endovenosa di cellule etichettate e la visualizzazione dei loro accumulo in organi bersaglio specifici o patologie. La tecnica è una dimostrazione il modo in cui l'etichetta cellule staminali mesenchimali (hMSC) semplice da incubazione con il colorante fluorescente lipofili DiD (C67H103CIN2O3S) e come etichetta cellule staminali embrionali umane (hESC) con la FDA ha approvato colorante fluorescente verde indocianina (ICG). Il meccanismo di assorbimento è attraverso l'aderenza e la diffusione del colorante lypophilic attraverso il doppio strato di fosfolipidi di membrana delle cellule. L'efficienza di etichettatura di solito è migliorata se le cellule sono incubate con il colorante nel siero privo di mezzi di comunicazione invece di incubazione nel siero contenenti media. Inoltre, l'aggiunta del solfato di protamina trasfezione agente migliora sensibilmente l'assorbimento agente di contrasto.
Protocol
Discussion
OI è una relativamente nuova tecnica di imaging, basato sul rilevamento di fluorescenza. OI è sensibile come radiofarmaco a base di tecniche di imaging, ma non associato ad alcuna esposizione irradiazione. OI fornisce un mezzo efficace di cellule monitoraggio non invasivo e ripetitivo, quindi permettono di approfondire la migrazione delle cellule al sito di destinazione. Una limitazione importante di questa tecnica è la penetrazione nei tessuti limitato di sonde fluorescenti in vivo. Così, un accumulo di tracciante nei tessuti profondi,…
Acknowledgements
Questo progetto è stato sostenuto da una borsa SEED J. Leon Thal del California Institute per la Medicina Rigenerativa. Tobias Henning è stato finanziato da una borsa di studio di ricerca dal tedesco Research Association (DFG, SE 4578/1-2). Vogliamo riconoscere con gratitudine Meneses Juanito per i suoi consigli sulla cultura di cellule staminali embrionali umane.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Indocyanine Green (IR-125) | Reagent | Fisher Scientific | AC41254-1000 | |
| DMSO | Reagent | Sigma | D-2650 | |
| D-MEM High Glucose | Reagent | Sigma | D5648 | |
| Gelatin | Reagent | Sigma | G1890 | Dilute to final concentration of 0.1% in PBS |
| PBS, Mg and Ca free | Reagent | GIBCO | 14190-144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Reagent | Invitrogen | 25300-120 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Reagent | Invitrogen | 25200-114 | |
| FCS, characterized | Reagent | Hyclone | SH30071.03 | |
| Cell Strainer (40 μm Nylon) | Reagent | BD Falcon | 352340 | |
| DiD | Reagent | Molecular Probes | V-22887 | |
| Knockout DMEM | Reagent | GIBCO | 10829018 | |
| Knockout Serum Replacer | Reagent | GIBCO | 10828028 | |
| b-Mercaptoethanol | Reagent | Sigma | 7522 | |
| Non-essential Amino Acids | Reagent | GIBCO | 11140050 | |
| FGF-2 | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Glutamine 200mM | Reagent | GIBCO | 25030081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Reagent | GIBCO | 15140-122 | |
| Protamine Sulfate | Reagent | American Pharmaceutical Partners Inc. |
References
- Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Metz, S., Piontek, G., Settles, M., Pichler, B., Heinzmann, U., Weinmann, H. J., Schlegel, J., Link, T. M., Rummeny, E. J., Oostendorp, R. A. J. Stem cell tracking with Gadophrin-2 — a bifunctional contrast agent for MR imaging, optical imaging and fluorescence microscopy. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 31, 1312-1321 (2004).
- Simon, G. H., Daldrup-Link, H. E., Kau, J., Metz, S., Schlegel, J., Piontek, G., Saborowski, O., Demos, S., Duyster, J., Pichler, B. J. Optical imaging of experimental arthritis using allogeneic leukocytes labeled with a near-infrared fluorescent probe. Eur J Nucl Med & Mol Imaging. 33, 998-1006 (2006).
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- Funovics, M. A., Alencar, H., Su, H. S., Khazaie, K., Weissleder, R., Mahmood, U. Miniaturized multichannel near infrared endoscope for mouse imaging. Mol Imaging. 2, 350-357 (2003).
