Wir zeigen eine einfache und schnelle Methode, um vordefinierte Anzahl von Zellen in mikrofabrizierten Brunnen laden und halten sie für Embryoidkörper Entwicklung.
Embryoid Körper (EB) sind Aggregate aus embryonalen Stammzellen. Die häufigste Art der Erstellung dieser Aggregate ist der hängende Tropfen-Methode, eine mühsame Annäherung Pipettieren eine beliebige Anzahl von Zellen in Mikrotiterplatten. Die Wechselwirkungen zwischen den Stammzellen in unmittelbarer Nähe voneinander gezwungen fördert die Generation der EBS. Weil die Medien in jede der Vertiefungen muss manuell ausgetauscht werden jeden Tag, ist dieser Ansatz manuell intensiv.
Darüber hinaus, weil Umwelt-Parameter einschließlich Zell-Zell-, Zell-löslichen Faktor-Interaktionen, pH und Sauerstoff Verfügbarkeit kann Funktionen der EB groß sein, können Zellpopulationen aus traditionellen hängende Tropfen erhalten dramatisch unterscheiden, auch wenn unter identischen Bedingungen kultiviert. Jüngste Studien haben zwar gezeigt, dass die anfängliche Anzahl von Zellen bilden das Aggregat kann erhebliche Auswirkungen auf Stammzell-Differenzierung haben. Wir haben eine einfache, schnelle und skalierbare Methode zur Kultur vordefinierten Anzahl von Zellen in mikrofabrizierten Brunnen laden und halten sie für Embryoidkörper Entwicklung entwickelt. Schließlich sind diese Zellen leicht zugänglich für weitere Analysen und Experimente. Diese Methode ist offen für jedes Labor und erfordert keine spezielle Ausrüstung. Wir demonstrieren diese Methode, indem Embryoidkörpern mit einem rot fluoreszierenden Maus-Zelllinie (129S6B6-F1).
Wir haben eine einfache, schnelle und skalierbare Methode zur Kultur vordefinierten Anzahl von Zellen in mikrostrukturierten Vertiefungen (geformt aus Shrinky-Dinks) zu laden und halten sie für Embryoidkörper Entwicklung entwickelt. Schließlich sind diese Zellen leicht zugänglich für weitere Analysen und Experimente. Diese Methode ist offen für jedes Labor und erfordert keine spezielle Ausrüstung, weil wir die Notwendigkeit für die Photolithographie zu vermeiden. Wir können variieren die Größe der Kavitäten sowie die Konzentrati…
Wir möchten CIRM für die Unterstützung dieser Arbeit danken. Die Zelllinie wurde großzügig von Dr. Andras Nagy am Mount Sinai Hospital, Toronto, Ontario gespendet.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Shrink-Dink Film | Material | K&B Innovations | D300-10A | |
PDMS | Material | Dow Corning | Sylgard 184 | |
Acetone | Reagent | Fisher Scientific | A16P-4 | |
Ethanol | Reagent | Fisher Scientific | A405P-4 | |
PBS | Reagent | Sigma | P4417 | |
BMP-4 | Reagent | R and D systems | 314-BP-010 | |
Knock-Out DMEM (KO DMEM) | Reagent | Invitrogen | 10829 | |
KnockOut Sirum Replacement (KSR) | Reagent | Invitrogen | 10828 | |
Penn-Strep | Reagent | Invitrogen | 15070-063 | |
L-glutamine | Reagent | Invitrogen | 25030-081 | |
Non-essential Amino Acids (NEAA) | Reagent | Invitrogen | 11140 | |
D-mercaptoethanol (BME) | Reagent | Calbiochem | 444203 | |
Leukemia Inhibitory Factor (LIF) {ESGRO 106 units} | Reagent | Chemicon | ESG1106 | |
Printer | Tool | HP | Laser Jet 2420d | |
Oven | Tool | Yamato Scientific | DP-22 | |
For the mESC media(McCloskey lab protocol): (for total media prepared: 50ml; 100ml) KO DMEM: 40.8ml; 81.6ml 15% KSR: 7.5ml; 15ml 1x Penn-Strep: .5ml; 1ml 2mM L-glutamine: .5ml; 1ml NEAA : .5ml; 1ml LIF: 100ul; 200ul BMP-4 (10ng/ml): 50ul; 100ul Diluted BME: 50ul; 100ul (Add 35ul of sterile filtered BME to 5ml of PBS and syringe filter sterilize. Discard after 2 weeks. Final concentration in the solution is .1mM) |