אנו מציגים שיטה פשוטה ומהירה כדי לטעון מוגדרים מראש מספרי של תאים לתוך בארות microfabricated ולשמור אותם לפיתוח גוף embryoid.
Abstract
גופים Embryoid (EB) הם אגרגטים של תאים עובריים. הדרך הנפוצה ביותר ליצירת אגרגטים אלה היא השיטה ירידה תלוי, גישה מייגע של pipetting מספר שרירותי של תאים לתוך צלחות היטב. אינטראקציות בין בתאי גזע בכפייה בסמיכות זה לזה מקדמת את הדור של EBS. בגלל התקשורת בכל בארות יש להחליף באופן ידני כל יום, גישה זו היא אינטנסיבית באופן ידני.
יתר על כן, בגלל פרמטרים סביבתיים כולל תאים תאים, תא מסיסים אינטראקציות גורם, pH, זמינות החמצן יכול להיות פונקציות של גודל EB, אוכלוסיות תאים המתקבל טיפות תלוי המסורתי יכול להשתנות באופן דרמטי, גם כאשר בתרבית בתנאים זהים. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי אכן מספר ראשוני של התאים המרכיבים את המצרף יכולה להיות השפעה משמעותית על התמיינות בתאי גזע. פיתחנו שיטה תרבות פשוטה, מהירה, וניתן להרחבה לטעון מוגדרים מראש מספרי של תאים לתוך בארות microfabricated ולשמור אותם לפיתוח גוף embryoid. לבסוף, תאים אלה נגישים בקלות לניתוח ניסויים נוספים. שיטה זו ניתנת לכל מעבדה ואינה דורשת ציוד ייעודי. אנו להדגים שיטה זו על ידי יצירת גופים embryoid באמצעות תא אדום ניאון העכבר קו (129S6B6-F1).
Protocol
1. ביצוע טיפולית נידחת עובש הדפס את התבנית הרצויה על גיליון טיפולית נידחת באמצעות מדפסת הגדרה טובה. אופים טיפולית נידחת בבית גיליון 163 מעלות למשך כ -10 דקות, או עד התכווץ באופן מלא לאחר שרכש צור…
Discussion
פיתחנו שיטה תרבות פשוטה, מהירה, וניתן להרחבה לטעון מוגדרים מראש מספרי של תאים לתוך בארות microfabricated (יצוק מ-טיפולית Dinks) ולשמור אותם לפיתוח גוף embryoid. לבסוף, תאים אלה נגישים בקלות לניתוח ניסויים נוספים. שיטה זו ניתנת לכל מעבדה ואינה דורשת ציוד ייעודי כי אנחנו לייתר את הצורך photolithography. …
Acknowledgements
ברצוננו להודות על התמיכה CIRM של עבודה זו. קו התא נתרם בנדיבות בבית החולים הר סיני, טורונטו, אונטריו מד"ר Andras נאגי.
For the mESC media(McCloskey lab protocol): (for total media prepared: 50ml; 100ml) KO DMEM: 40.8ml; 81.6ml 15% KSR: 7.5ml; 15ml 1x Penn-Strep: .5ml; 1ml 2mM L-glutamine: .5ml; 1ml NEAA : .5ml; 1ml LIF: 100ul; 200ul BMP-4 (10ng/ml): 50ul; 100ul Diluted BME: 50ul; 100ul (Add 35ul of sterile filtered BME to 5ml of PBS and syringe filter sterilize. Discard after 2 weeks. Final concentration in the solution is .1mM)
Chen, C., Pegan, J., Luna, J., Xia, B., McCloskey, K., Chin, W., Khine, M. Shrinky-Dink Hanging Drops: A Simple Way to Form and Culture Embryoid Bodies. J. Vis. Exp. (13), e692, doi:10.3791/692 (2008).