Shrinky Dink-Hanging Drops: Uma maneira simples para formar e Cultura corpos embrióides
Summary
Vamos mostrar um método simples e rápido para carregar números pré-definidos de células em poços microfabricated e mantê-los para o desenvolvimento do corpo embrióides.
Abstract
Corpos embrióides (EB) são agregados de células-tronco embrionárias. A forma mais comum de criar esses agregados é o método de gota em suspensão, uma abordagem laboriosa de pipetagem um número arbitrário de células em placas bem. As interações entre as células-tronco forçado a estreita proximidade um do outro promove a geração dos EBs. Porque a mídia em cada um dos poços tem que ser trocado manualmente todos os dias, esta abordagem é manualmente intensivo.
Além disso, porque os parâmetros ambientais, incluindo a célula-célula, as interações célula-soluble fator, pH, ea disponibilidade de oxigênio podem ser funções de tamanho EB, populações de células obtidas a partir tradicionais gotas de suspensão pode variar drasticamente, mesmo quando cultivadas em condições idênticas. Estudos recentes têm mostrado que na verdade o número inicial de células que formam o agregado pode ter efeitos significativos sobre a diferenciação de células-tronco. Nós desenvolvemos um método de cultura simples, rápida e escalável para carregar números pré-definidos de células em poços microfabricated e mantê-los para o desenvolvimento do corpo embrióides. Finalmente, essas células são facilmente acessíveis para posterior análise e experimentação. Este método é passível de qualquer laboratório e não exige equipamentos dedicados. Nós demonstrar este método, criando corpos embrióides usando uma linha de células vermelhas fluorescentes mouse (129S6B6-F1).
Protocol
Discussion
Nós desenvolvemos um método de cultura simples, rápida e escalável para carregar números pré-definidos de células em poços microfabricated (moldados a partir Shrinky-Dinks) e mantê-los para o desenvolvimento do corpo embrióides. Finalmente, essas células são facilmente acessíveis para posterior análise e experimentação. Este método é passível de qualquer laboratório e não exige equipamentos dedicados, porque evitaria a necessidade de fotolitografia. Podemos variar o tamanho dos poços, bem como a concentração de célu…
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer a CIRM para apoiar este trabalho. A linhagem celular foi generosamente doado pelo Dr. Andras Nagy no Mount Sinai Hospital, Toronto, Ontário.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Shrink-Dink Film | Material | K&B Innovations | D300-10A | |
| PDMS | Material | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Acetone | Reagent | Fisher Scientific | A16P-4 | |
| Ethanol | Reagent | Fisher Scientific | A405P-4 | |
| PBS | Reagent | Sigma | P4417 | |
| BMP-4 | Reagent | R and D systems | 314-BP-010 | |
| Knock-Out DMEM (KO DMEM) | Reagent | Invitrogen | 10829 | |
| KnockOut Sirum Replacement (KSR) | Reagent | Invitrogen | 10828 | |
| Penn-Strep | Reagent | Invitrogen | 15070-063 | |
| L-glutamine | Reagent | Invitrogen | 25030-081 | |
| Non-essential Amino Acids (NEAA) | Reagent | Invitrogen | 11140 | |
| D-mercaptoethanol (BME) | Reagent | Calbiochem | 444203 | |
| Leukemia Inhibitory Factor (LIF) {ESGRO 106 units} | Reagent | Chemicon | ESG1106 | |
| Printer | Tool | HP | Laser Jet 2420d | |
| Oven | Tool | Yamato Scientific | DP-22 | |
| For the mESC media(McCloskey lab protocol): (for total media prepared: 50ml; 100ml) KO DMEM: 40.8ml; 81.6ml 15% KSR: 7.5ml; 15ml 1x Penn-Strep: .5ml; 1ml 2mM L-glutamine: .5ml; 1ml NEAA : .5ml; 1ml LIF: 100ul; 200ul BMP-4 (10ng/ml): 50ul; 100ul Diluted BME: 50ul; 100ul (Add 35ul of sterile filtered BME to 5ml of PBS and syringe filter sterilize. Discard after 2 weeks. Final concentration in the solution is .1mM) | ||||
References
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