Shrinky-Dink colgante Gotas: Una manera sencilla de Forma y Cultura cuerpos embrioides
Summary
Nos muestran un método sencillo y rápido para cargar previamente definidos el número de células en los pozos microfabricated y mantenimiento para el desarrollo del cuerpo embrioides.
Abstract
Cuerpos embrioides (EB) son agregados de células madre embrionarias. La forma más común de la creación de estos agregados es el método de la gota colgante, un enfoque laborioso de pipeteo un número arbitrario de las células en placas. Las interacciones entre las células madre obligado a cerca de uno al otro promueve la generación de la EBS. Debido a que los medios de comunicación en cada uno de los pozos tiene que ser intercambiados de forma manual todos los días, este enfoque es manual intensivo.
Además, debido a los parámetros ambientales como la célula-célula, las células interacciones de los factores solubles, pH, y la disponibilidad de oxígeno pueden ser funciones del tamaño de EB, las poblaciones de células obtenidas a partir de gotas colgantes tradicionales pueden variar considerablemente, incluso cuando se cultivan en condiciones idénticas. Estudios recientes han demostrado claramente que el número inicial de células que forman el conjunto puede tener efectos significativos sobre la diferenciación de células madre. Hemos desarrollado un método de cultivo sencillo, rápido y escalable para la carga de pre-definidos del número de células en los pozos microfabricated y mantenimiento para el desarrollo del cuerpo embrioides. Por último, estas células son fácilmente accesibles para su posterior análisis y la experimentación. Este método se presta a cualquier laboratorio y no requiere equipo especializado. Se demuestra que este método mediante la creación de cuerpos embrioides con una línea roja fluorescente de células de ratón (129S6B6-F1).
Protocol
Discussion
Hemos desarrollado un método de cultivo sencillo, rápido y escalable para la carga de pre-definidos del número de células en los pozos microfabricated (moldeados a partir de Shrinky-Dinks) y mantenimiento para el desarrollo del cuerpo embrioides. Por último, estas células son fácilmente accesibles para su posterior análisis y la experimentación. Este método se presta a cualquier laboratorio y no requiere equipo especializado, ya que elimina la necesidad de fotolitografía. Podemos variar el tamaño de las cúpulas, así como la co…
Acknowledgements
Nos gustaría dar las gracias al CIRM para apoyar este trabajo. La línea celular fue generosamente donada por el Dr. Andras Nagy en el Mount Sinai Hospital, Toronto, Ontario.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Shrink-Dink Film | Material | K&B Innovations | D300-10A | |
| PDMS | Material | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Acetone | Reagent | Fisher Scientific | A16P-4 | |
| Ethanol | Reagent | Fisher Scientific | A405P-4 | |
| PBS | Reagent | Sigma | P4417 | |
| BMP-4 | Reagent | R and D systems | 314-BP-010 | |
| Knock-Out DMEM (KO DMEM) | Reagent | Invitrogen | 10829 | |
| KnockOut Sirum Replacement (KSR) | Reagent | Invitrogen | 10828 | |
| Penn-Strep | Reagent | Invitrogen | 15070-063 | |
| L-glutamine | Reagent | Invitrogen | 25030-081 | |
| Non-essential Amino Acids (NEAA) | Reagent | Invitrogen | 11140 | |
| D-mercaptoethanol (BME) | Reagent | Calbiochem | 444203 | |
| Leukemia Inhibitory Factor (LIF) {ESGRO 106 units} | Reagent | Chemicon | ESG1106 | |
| Printer | Tool | HP | Laser Jet 2420d | |
| Oven | Tool | Yamato Scientific | DP-22 | |
| For the mESC media(McCloskey lab protocol): (for total media prepared: 50ml; 100ml) KO DMEM: 40.8ml; 81.6ml 15% KSR: 7.5ml; 15ml 1x Penn-Strep: .5ml; 1ml 2mM L-glutamine: .5ml; 1ml NEAA : .5ml; 1ml LIF: 100ul; 200ul BMP-4 (10ng/ml): 50ul; 100ul Diluted BME: 50ul; 100ul (Add 35ul of sterile filtered BME to 5ml of PBS and syringe filter sterilize. Discard after 2 weeks. Final concentration in the solution is .1mM) | ||||
References
- Keller, G. M. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Curr Opin Cell Biol. 7, 862-869 (1995).
- Doetschman, T. C., Eistetter, H., Katz, M., Schmidt, W., Kemler, R. The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: Formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 87, 27-45 (1985).
- Park, J., Cho, C. H., Parashurama, N., Li, Y., Berthiaume, F., Toner, M., Tilles, A. W., Yarmush, M. L. Microfabrication-based modulation of embryonic stem cell differentiation. Lab Chip. 7, 1018-1028 (2007).
- Koike, M., Sakaki, S., Amano, Y., Kurosawa, H. Characterization of embryoid bodies of mouse embryonic stem cells formed under various culture conditions and estimation of differentiation status of such bodies. J Biosci Bioeng. 104, 294-299 (2007).
- Hwang, N. S., Varghese, S., Elisseeff, J. Controlled differentiation of stem cells. Advanced Drug Delivery Reviews. 60, 199-204 (2008).
- Adelman, C. A., Chattopadhyay, S., Bieker, J. J. The BMP/BMPR/Smad pathway directs expression of the erythroid-specific EKLF and GATA1 transcription factors during embryoid body differentiation in serum-free media. Development. 129, 539-549 (2002).
- Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, O. V., Sills, E. S. Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system: applications and preliminary results in a murine model. J Transl Med. 4, (2006).
