Damlalar Asma Shrinky Dink: embriyoid Organları Formu ve Kültür Basit Yolu
Summary
Biz microfabricated kuyu içine hücrelerin önceden tanımlı numaralar yüklemek ve embriyoid vücut gelişimi için onları korumak için basit ve hızlı bir yöntem gösteriyor.
Abstract
Embriyoid organları (EB), embriyonik kök hücrelerin agrega. Bu agrega oluşturarak en yaygın yolu, asılı damla yöntemi, kuyucuğu keyfi bir hücre sayısı pipetleme zahmetli bir yaklaşım. Birbirlerine yakın zorla kök hücreleri arasındaki etkileşimler EBS üretimi teşvik etmektedir. Kuyuların her medya her gün el değiştirebileceği sahip olduğundan, bu yaklaşımın elle yoğundur.
Ayrıca, aynı koşullar altında kültüre, hücre-hücre, hücre eriyen faktör etkileşimleri, pH ve oksijen kullanılabilirliği de dahil olmak üzere çevresel parametrelerin EB boyutu fonksiyonlar olabilir, çünkü, geleneksel asılı damla elde edilen hücre popülasyonlarının bile dramatik olarak değişebilir. Son çalışmalar gerçekten ilk sayıda toplu oluşturan hücrelerin kök hücre farklılaşması üzerinde önemli etkilere sahip olduğunu göstermiştir. Biz microfabricated kuyu içine hücrelerin önceden tanımlı numaralar yüklemek ve embriyoid vücut gelişimi için onları korumak için, basit, hızlı ve ölçeklenebilir bir kültür yöntemi geliştirdik. Son olarak, bu hücreler daha fazla analiz ve deney için kolayca ulaşılabilir. Bu yöntem, herhangi bir laboratuvar için uygun ve hiçbir özel ekipman gerektirir. Biz kırmızı floresan fare hücre hattı (129S6B6 F1) kullanarak embriyoid organları oluşturarak bu yöntemi göstermektedir.
Protocol
Discussion
Biz microfabricated kuyuları (Shrinky-Dinks kalıplı), hücrelerin önceden tanımlı numaralar yüklemek ve embriyoid vücut gelişimi için onları korumak için, basit, hızlı ve ölçeklenebilir bir kültür yöntemi geliştirdik. Son olarak, bu hücreler daha fazla analiz ve deney için kolayca ulaşılabilir. Bu yöntem, herhangi bir laboratuvar için uygun ve fotolitografi için gerek bırakmayacak, çünkü hiçbir özel ekipman gerektirir. Biz embriyoid organlarının sayısını ve boyutunu değiştirmek için mikro oyukların …
Acknowledgements
CIRM Biz bu işi destek için teşekkür etmek istiyorum. Hücre hattı cömertçe, Toronto Mount Sinai Hastanesi Dr. Andras Nagy bağışlanmıştır.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Shrink-Dink Film | Material | K&B Innovations | D300-10A | |
| PDMS | Material | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Acetone | Reagent | Fisher Scientific | A16P-4 | |
| Ethanol | Reagent | Fisher Scientific | A405P-4 | |
| PBS | Reagent | Sigma | P4417 | |
| BMP-4 | Reagent | R and D systems | 314-BP-010 | |
| Knock-Out DMEM (KO DMEM) | Reagent | Invitrogen | 10829 | |
| KnockOut Sirum Replacement (KSR) | Reagent | Invitrogen | 10828 | |
| Penn-Strep | Reagent | Invitrogen | 15070-063 | |
| L-glutamine | Reagent | Invitrogen | 25030-081 | |
| Non-essential Amino Acids (NEAA) | Reagent | Invitrogen | 11140 | |
| D-mercaptoethanol (BME) | Reagent | Calbiochem | 444203 | |
| Leukemia Inhibitory Factor (LIF) {ESGRO 106 units} | Reagent | Chemicon | ESG1106 | |
| Printer | Tool | HP | Laser Jet 2420d | |
| Oven | Tool | Yamato Scientific | DP-22 | |
| For the mESC media(McCloskey lab protocol): (for total media prepared: 50ml; 100ml) KO DMEM: 40.8ml; 81.6ml 15% KSR: 7.5ml; 15ml 1x Penn-Strep: .5ml; 1ml 2mM L-glutamine: .5ml; 1ml NEAA : .5ml; 1ml LIF: 100ul; 200ul BMP-4 (10ng/ml): 50ul; 100ul Diluted BME: 50ul; 100ul (Add 35ul of sterile filtered BME to 5ml of PBS and syringe filter sterilize. Discard after 2 weeks. Final concentration in the solution is .1mM) | ||||
References
- Keller, G. M. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Curr Opin Cell Biol. 7, 862-869 (1995).
- Doetschman, T. C., Eistetter, H., Katz, M., Schmidt, W., Kemler, R. The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: Formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 87, 27-45 (1985).
- Park, J., Cho, C. H., Parashurama, N., Li, Y., Berthiaume, F., Toner, M., Tilles, A. W., Yarmush, M. L. Microfabrication-based modulation of embryonic stem cell differentiation. Lab Chip. 7, 1018-1028 (2007).
- Koike, M., Sakaki, S., Amano, Y., Kurosawa, H. Characterization of embryoid bodies of mouse embryonic stem cells formed under various culture conditions and estimation of differentiation status of such bodies. J Biosci Bioeng. 104, 294-299 (2007).
- Hwang, N. S., Varghese, S., Elisseeff, J. Controlled differentiation of stem cells. Advanced Drug Delivery Reviews. 60, 199-204 (2008).
- Adelman, C. A., Chattopadhyay, S., Bieker, J. J. The BMP/BMPR/Smad pathway directs expression of the erythroid-specific EKLF and GATA1 transcription factors during embryoid body differentiation in serum-free media. Development. 129, 539-549 (2002).
- Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, O. V., Sills, E. S. Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system: applications and preliminary results in a murine model. J Transl Med. 4, (2006).
