一个人脑组织中的染色质含量

Summary

直到最近，表达对人类大脑的研究仅限于RNA或蛋白质的定量。本文中所描述的染色质免疫沉淀技术，将有可能映射在死后大脑基因表达的组蛋白甲基化和其他后生监管。

Abstract

慢性神经精神疾病如精神分裂症，双相情感疾病和自闭症被认为是导致从遗传和环境因素可能会导致基因表达和其他分子病理学遗传学改变相结合。然而，传统上，死后大脑中的表达研究局限于基因或蛋白质的量化。在死后大脑的研究，如在自溶时间的可变性和组织integrities中遇到的限制也可能会影响到任何高阶的染色质结构研究。然而，基因组DNA的核小体的组织，包括的DNA：核心组蛋白具有约束力 – 看来主要是由不同的大脑银行提供的有代表性的样品保存。因此，它是研究在死后大脑中定义的基因位点的核心组蛋白的甲基化模式和其他共价修饰。在这里，我们提出一个简化的本地冻结（从来没有固定的）人类的大脑标本的染色质免疫沉淀（NChIP）协议。微球菌核酸酶的消化脑组织匀浆开始，NChIP由qPCR的三天之内就可以完成。这里介绍的方法应该是有用的，以澄清在正常和病变的人类大脑基因表达的表观遗传机制。

Protocol

程序： 第一日 1。均质与Douncing缓冲区50-500毫克冷冻验尸报告灰色的事情组织。 ！注意-人体组织必须谨慎处理，严格的安全条件下。它应在BSL – 2或更高的安全标准来处理。 以前解剖，验尸报告的大脑从-80 °，dounce Douncing缓冲区5X大脑体积，并在2.0 ml离心管地方。匹配的样品，并控制对同时处理。 <p c…

Discussion

这里列出的协议在人类大脑的组蛋白和/或DNA甲基化签名感兴趣的调查是非常有用的的，因为这些染色标记可能不容易死后文物相比，其他类型的修改，包括（组蛋白）的^乙酰化和磷酸化1的， ^2。死后的大脑，是适合单核小体的准备的研究，在很大程度上仍然连接到核心组蛋白的DNA，至少在与代表自溶的时间间隔（死亡和冻结/储存组织之间的时间）范围内的典型标本，几个小时至1.5天。然而，单?…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Tris-HCl		EMD	9310
Magnesium Chloride Hexahydrate		OmniPur	5980
Calcium Chloride		Fisher Scientific	C614-3
EDTA, 0.5M Solution, pH8.0		OmniPur	4055
Sodium Chloride		Mallinckrodt Chemicals	7581-06
SDS Solution 10% (w/v)		Bio-Rad	161-0416
Triton X-100		Fluka	93426
Igepal CA-630		Sigma	I-3021
Sodium Deoxycholate		Sigma	D6750-25G
Lithium Chloride		Sigma	L9650-100G
Sodium Bicarbonate		Sigma	S7277-250G
Sodium Acetate (anhydrous)		Sigma	S-2889
Nuclease micrococcal from Staphylococcus		Sigma	N3755-200UN
Benzamidine		Fluka	12072
Phenylmethanesulfonylfluoride		Sigma	P7626-1G
3M DTT		Fluka	43815
Protein G Agarose, Fast Flow		Upstate	16-266
Sonicated Salmon Sperm DNA Kit		Stratagene	201190
Proteinase K from Engyodontium album		Sigma	P2308
Phenol:Chloroform 1:1		OmniPur	6810
Glycogen, From Mussels		Sigma	G1767-1VL
Ethyl Alcohol (200 Proof)		Pharmco-AAPER	111000200

Solutions:

• nChIP Douncing Buffer : 10 mM Tris, 4 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂ adjust pH to 7.5
• 10x FSB: 50 mM EDTA, 200 mM Tris, 500 mM NaCl adjust pH to 7.5
• Low salt washing buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl
• High salt washing Buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (Ph 8), 500 mM NaCl
• Lithium Chloride Buffer: 1% IGEPAL-CA 630, 1% Deoxycholic acid, 1 mM EDTA (pH 8), 10 mM Tris (pH 8), 0.25 M LiCl
• TE buffer: 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA
• Elution Buffer: 0.1M NaHCO₃, 1% SDS
• Proteinase K digestion buffer (10X): 1M Tris, 50 mM EDTA, 2% SDS, 2M NaCl adjust pH to 8.0
• 3 M Sodium Acetate: 24.61 g anhydrous sodium acetate (M.W.=82.03) in 100 mL of autoclaved distilled water. Adjust pH to 5.2 using concentrated acetic acid.