Un dosage de la chromatine pour les tissus du cerveau humain
Summary
Jusqu'à récemment, les études d'expression sur le cerveau humain ont été limités à la quantification de l'ARN ou les protéines. Avec les techniques d'immunoprécipitation de chromatine décrites dans ce document, il sera possible de cartographier la méthylation des histones et d'autres régulateurs épigénétiques de l'expression des gènes dans le cerveau post-mortem.
Abstract
Chronique maladies neuropsychiatriques comme la schizophrénie, la maladie bipolaire et l'autisme sont considérés comme le résultat d'une combinaison de facteurs génétiques et environnementaux qui pourraient résulter de modifications épigénétiques de l'expression génique et d'autres pathologie moléculaire. Traditionnellement, cependant, les études d'expression dans le cerveau post-mortem ont été confinés à la quantification de l'ARNm ou de protéines. Les limites rencontrées dans la recherche du cerveau post-mortem tels que des variabilités dans le temps et l'autolyse des tissus intégrités sont également susceptibles d'affecter toutes les études des structures supérieures chromatine ordre. Cependant, l'organisation de l'ADN génomique nucléosomiques y compris l'ADN: core histones contraignant – semble largement préservées dans des échantillons représentatifs fournis par les banques du cerveau différentes. Par conséquent, il est possible d'étudier le modèle de méthylation et d'autres modifications covalentes des histones fondamentales définies au loci génomiques dans le cerveau post-mortem. Ici, nous présentons une version simplifiée natif immunoprécipitation de la chromatine (NChIP Protocol) pour les échantillons congelés du cerveau (jamais fixe) humaine. En commençant par la nucléase micrococcal digestion des homogénats de cerveaux, NChIP suivie par qPCR peut être complété dans les trois jours. La méthodologie présentée ici devrait être utile pour élucider les mécanismes épigénétiques de l'expression des gènes dans le cerveau humain normal et pathologique.
Protocol
Discussion
Le protocole décrit ici est particulièrement utile pour les chercheurs intéressés dans les signatures de méthylation des histones et / ou de l'ADN du cerveau humain, parce que ces marques chromatine peuvent être moins enclins à des artéfacts post mortem par rapport à d'autres types de modifications, y compris (histones) acétylation et la phosphorylation 1, 2. Le cerveau post-mortem se prêtent à l'étude de la mono-nucléosomes préparations; l'ADN reste largement attachée à la histones, au moins dans…
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par une subvention du National Institute of Mental Health (5R01MH071476).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Tris-HCl | EMD | 9310 | ||
| Magnesium Chloride Hexahydrate | OmniPur | 5980 | ||
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C614-3 | ||
| EDTA, 0.5M Solution, pH8.0 | OmniPur | 4055 | ||
| Sodium Chloride | Mallinckrodt Chemicals | 7581-06 | ||
| SDS Solution 10% (w/v) | Bio-Rad | 161-0416 | ||
| Triton X-100 | Fluka | 93426 | ||
| Igepal CA-630 | Sigma | I-3021 | ||
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750-25G | ||
| Lithium Chloride | Sigma | L9650-100G | ||
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S7277-250G | ||
| Sodium Acetate (anhydrous) | Sigma | S-2889 | ||
| Nuclease micrococcal from Staphylococcus | Sigma | N3755-200UN | ||
| Benzamidine | Fluka | 12072 | ||
| Phenylmethanesulfonylfluoride | Sigma | P7626-1G | ||
| 3M DTT | Fluka | 43815 | ||
| Protein G Agarose, Fast Flow | Upstate | 16-266 | ||
| Sonicated Salmon Sperm DNA Kit | Stratagene | 201190 | ||
| Proteinase K from Engyodontium album | Sigma | P2308 | ||
| Phenol:Chloroform 1:1 | OmniPur | 6810 | ||
| Glycogen, From Mussels | Sigma | G1767-1VL | ||
| Ethyl Alcohol (200 Proof) | Pharmco-AAPER | 111000200 |
Solutions:
- nChIP Douncing Buffer : 10 mM Tris, 4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 adjust pH to 7.5
- 10x FSB: 50 mM EDTA, 200 mM Tris, 500 mM NaCl adjust pH to 7.5
- Low salt washing buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl
- High salt washing Buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (Ph 8), 500 mM NaCl
- Lithium Chloride Buffer: 1% IGEPAL-CA 630, 1% Deoxycholic acid, 1 mM EDTA (pH 8), 10 mM Tris (pH 8), 0.25 M LiCl
- TE buffer: 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA
- Elution Buffer: 0.1M NaHCO3, 1% SDS
- Proteinase K digestion buffer (10X): 1M Tris, 50 mM EDTA, 2% SDS, 2M NaCl adjust pH to 8.0
- 3 M Sodium Acetate: 24.61 g anhydrous sodium acetate (M.W.=82.03) in 100 mL of autoclaved distilled water. Adjust pH to 5.2 using concentrated acetic acid.
References
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