العزلة وتحليل الخلايا الجذعية المكونة للدم من المشيمة

Summary

حددنا المشيمة ، بوصفها الجهاز الرئيسي للدم خلال التنمية. وجدنا أن كلا إنشاء خلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) ، وتوسعت في المشيمة في محاريب microenvironmental فريدة من نوعها. هنا ، نحن تصف التقنيات التجريبية المطلوبة للعزلة وتصور HSCs في المشيمة الماوس.

Abstract

الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) لديها القدرة على تجديد الذات وتوليد كل أنواع الخلايا من الدم في جميع أنحاء الأنساب عمر الفرد. جميع HSCs تظهر خلال نمو الجنين ، وبعد ذلك يتم الاحتفاظ حجمها تجمع بواسطة الذاتي تجديد الانقسامات الخلوية. تحديد المنشأ التشريحي للHSCs والأحداث الحاسمة التنموية التي تنظم عملية التنمية HSC تعقدت كمواقع تشريحية كثيرة خلال المشاركة تكون الدم في الجنين. مؤخرا ، حددنا المشيمة ، بوصفها الجهاز الرئيسي للدم حيث يتم إنشاء HSCs وتوسعت في محاريب microenvironmental فريد (جيكاس ، وآخرون 2005 ، ورودس ، وآخرون 2008). وبالتالي فإن المشيمة مصدر مهم من خلال ظهور HSCs وتوسعها الأولية.

في هذه المقالة ، نعرض أساليب تشريح للعزلة المشيمة من الفئران وE10.5 E12.5 الأجنة ، المقابلة لمراحل تطور بدء HSCs والذروة في حجم تجمع HSC في المشيمة ، على التوالي. بالإضافة إلى ذلك ، فإننا نقدم بروتوكول الأمثل لتفارق الأنزيمية والميكانيكية للأنسجة المشيمة وحيدة الخلية في تعليق لاستخدامها في التدفق الخلوي أو المقايسات الفنية. لقد وجدنا أن استخدام كولاجيناز عن وحيدة الخلية تعليق المشيمة يعطي غلة كافية من HSCs. عامل مهم يؤثر HSC العائد من المشيمة هي درجة التفكك الميكانيكية قبل ، ومدتها ، ومعالجة القرنية.

ونحن نقدم أيضا على بروتوكول لإعداد الثابتة المجمدة أقسام النسيج المشيمي لوضع التصور HSCs بواسطة المناعية الخلوية في مطلبهم دقيقة. كما لا يتم الاحتفاظ مستضدات محددة للدم أثناء إعداد الأبواب جزءا لا يتجزأ من البارافين ، ونحن نستخدم بشكل روتيني المجمدة أقسام ثابتة لتوطين HSCs المشيمة والأسلاف.

Protocol

1. إزالة الجنين والمشيمة تشريح لتبدأ ، يجب أن تكون معزولة أول أجنة الحوامل من السدود. يصرح باستخدامها في الحيوانات وفقا للإجراءات المعتمدة — في حالتنا نحن نذهب إلى استخدام جرعة قاتلة من مخدر …

Discussion

والإجراءات التجريبية وصفها في هذا البروتوكول يسمح للعزلة والتصور من نسيج المشيمة والخلايا الجذعية المكونة للدم والسلف. للحصول على ملخص شامل عن العائد المتوقع الخليوي وعدد من HSCs في المشيمة وغيرها من الأجهزة المكونة للدم الجنين خلال مراحل تطوره الجنين نشير إلى جيكاس ، وآخرون. 200…

Materials

Materials List:
100mM Glucose
10mM NaN3
15-ml conical tubes (BD)
16-G, 18-G, 20-G, 22-G and 25-G needles (BD)
30% Sucrose Solution
35mm Petri Dishes (BD)
4% Paraformaldehyde
50- m cell filters (Celltrics)
5-ml syringes (BD)
Alkaline Phosphatase Substrate Kit I (Vector Red, Vector)
Alkaline Phosphatase Substrate Kit III (Vector Blue, Vector)
Antibiotic (Penicillin/Streptomycin, P/S) solution
Collagenase type I (Sigma)
Cryomold Disposable Vinyl Specimen Molds (10mm x 10mm x 5 mm, Tissue-Tek)
Cytokeratin Primary Antibody (DakoCytomation)
Dissection forceps, stainless steel or titanium, number 5 or 55
Drierite
Fetal Bovine Serum (FBS)
Fisherbrand Plastic Microscope Slide Mailer (Fisher)
Glucose Oxidase 1000u/ml
Levamisole (Vector)
Mounting media, Aqueous-based Mounting Medium (VectamountTM AQ)
Normal Horse Serum (Vector)
Optimal Cutting Temperature (O.C.T., Tissue-Tek)
Peroxidase Substrate Kit DAB (Vector)
Phosphate Buffered Saline (PBS) with Calcium/Magnesium (w Ca2+/Mg2+)
Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium/Magnesium (w/o Ca2+/Mg2+)
Plastic Slide Box (holds 100 slides)
Plastic Tubing (Nalgene 180 PVC Non-toxic Autoclavable)
Polypropylene Round-Bottom Test Tube, 5 ml (12×75 mm, BD Falcon)
Proteinase K 20mg/ml Solution (Amresco)
Research Products International Corp Super Pap Pen HT* Slide Markers (2,5 mm, Fisher)
Tissue-culture treated U-shaped (round-bottom) 96-well or 24-well plates (BD Falcon)
Tween20, SigmaUltra (Sigma)
Tyramide Amplification Kit (Invitrogen)
Vectastain ABC Alkaline Phosphatase Standard Kit (Vector)
Vectastain ABC Standard Elite Kit (Vector)