Isolement et analyse de cellules souches hématopoïétiques à partir du placenta

Summary

Nous avons identifié le placenta comme un organe majeur lors du développement hématopoïétique. Nous avons constaté que les cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont à la fois générées et développées dans le placenta dans des niches uniques microenvironnementales. Ici, nous décrivons des techniques expérimentales nécessaires à l'isolement et la visualisation des CSH dans le placenta de souris.

Abstract

Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) ont la capacité de s'auto-renouveler et de générer tous les types de cellules des lignées de sang à travers la vie d'un individu. Tous les CSH apparaissent pendant le développement embryonnaire, après quoi leurs dimensions de la piscine est maintenue par l'auto-renouvellement des divisions cellulaires. Identifier l'origine anatomique des CSH et les événements critiques de développement régulation du processus de développement HSC a été compliqué car beaucoup de sites anatomiques participer durant l'hématopoïèse fœtale. Récemment, nous avons identifié le placenta comme un organe majeur où les CSH hématopoïétiques sont générées et élargi dans des niches uniques microenvironnementales (Gekas, et al 2005, à Rhodes, et al 2008). En conséquence, le placenta est une source importante de CSH au cours de leur émergence et l'expansion initiale.

Dans cet article, nous montrons les techniques de dissection pour l'isolement du placenta de souris E10.5 E12.5 et embryons, ce qui correspond aux étapes de développement de l'initiation des CSH et le pic de la taille de la piscine HSC dans le placenta, respectivement. En outre, nous présentons un protocole optimisé pour la dissociation enzymatique et mécanique du tissu placentaire dans une seule cellule de suspension pour une utilisation en cytométrie en flux ou des tests fonctionnels. Nous avons constaté que l'utilisation de la collagénase pour une seule cellule de suspension du placenta donne des rendements suffisants de CSH. Un facteur important affectant le rendement HSC du placenta est le degré de dissociation mécanique avant, et la durée de traitement enzymatique.

Nous fournissons également un protocole pour la préparation de surgelés fixe des coupes de tissus placentaires pour la visualisation de développer CSH par immunohistochimie dans leurs niches précises cellulaire. Comme hématopoïétiques antigènes spécifiques ne sont pas conservés lors de la préparation des sections paraffine, nous utilisent couramment fixes coupes congelées pour localiser les CSH et les progéniteurs placentaire.

Protocol

1. Retrait de l'embryon et du placenta de dissection Pour commencer, les embryons doivent d'abord être isolés à partir des barrages enceinte. Les animaux sont euthanasiés selon les procédures approuvées – dans notre cas nous allons utiliser une dose létale de l'isoflurane anesthésie Tout d'abord, le ventre de pulvérisation avec de l'éthanol et de faire une petite incision avec une paire de ciseaux. Arrachez la peau avec les deux mains pour découvrir …

Discussion

Les procédures expérimentales décrites dans ce protocole permettra à l'isolement et la visualisation des tissus placentaires et souches hématopoïétiques et les cellules progénitrices. Pour un résumé complet sur le rendement attendu et cellulaires nombre de CSH dans le placenta et les autres organes hématopoïétiques fœtales à travers le développement du fœtus nous nous référons à Gekas, et al. 2005. Pour la localisation des CSH en développement et d'autres cellules hématopoïétiques dans le placenta nous nous r…

Materials

Materials List:
100mM Glucose
10mM NaN3
15-ml conical tubes (BD)
16-G, 18-G, 20-G, 22-G and 25-G needles (BD)
30% Sucrose Solution
35mm Petri Dishes (BD)
4% Paraformaldehyde
50- m cell filters (Celltrics)
5-ml syringes (BD)
Alkaline Phosphatase Substrate Kit I (Vector Red, Vector)
Alkaline Phosphatase Substrate Kit III (Vector Blue, Vector)
Antibiotic (Penicillin/Streptomycin, P/S) solution
Collagenase type I (Sigma)
Cryomold Disposable Vinyl Specimen Molds (10mm x 10mm x 5 mm, Tissue-Tek)
Cytokeratin Primary Antibody (DakoCytomation)
Dissection forceps, stainless steel or titanium, number 5 or 55
Drierite
Fetal Bovine Serum (FBS)
Fisherbrand Plastic Microscope Slide Mailer (Fisher)
Glucose Oxidase 1000u/ml
Levamisole (Vector)
Mounting media, Aqueous-based Mounting Medium (VectamountTM AQ)
Normal Horse Serum (Vector)
Optimal Cutting Temperature (O.C.T., Tissue-Tek)
Peroxidase Substrate Kit DAB (Vector)
Phosphate Buffered Saline (PBS) with Calcium/Magnesium (w Ca2+/Mg2+)
Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium/Magnesium (w/o Ca2+/Mg2+)
Plastic Slide Box (holds 100 slides)
Plastic Tubing (Nalgene 180 PVC Non-toxic Autoclavable)
Polypropylene Round-Bottom Test Tube, 5 ml (12×75 mm, BD Falcon)
Proteinase K 20mg/ml Solution (Amresco)
Research Products International Corp Super Pap Pen HT* Slide Markers (2,5 mm, Fisher)
Tissue-culture treated U-shaped (round-bottom) 96-well or 24-well plates (BD Falcon)
Tween20, SigmaUltra (Sigma)
Tyramide Amplification Kit (Invitrogen)
Vectastain ABC Alkaline Phosphatase Standard Kit (Vector)
Vectastain ABC Standard Elite Kit (Vector)