Isolamento e analisi delle cellule staminali ematopoietiche dalla placenta

Summary

Abbiamo identificato la placenta come organo principale ematopoietiche durante lo sviluppo. Abbiamo trovato che le cellule staminali ematopoietiche (HSC) sono entrambi generati e ampliato nella placenta in unica nicchie microambientali. Qui, descriviamo le tecniche sperimentali necessari per l'isolamento e la visualizzazione di cellule staminali nella placenta del mouse.

Abstract

Le cellule staminali ematopoietiche (HSC) hanno la capacità di auto-rinnovarsi e di generare tutti i tipi di cellule dei lignaggi di sangue per tutta la durata di un individuo. Tutte le CSE emergono durante lo sviluppo embrionale, dopo di che le loro dimensioni piscina è gestito da auto-rigenerante divisioni cellulari. Identificare l'origine anatomica di cellule staminali e gli eventi critici dello sviluppo che regolano il processo di sviluppo HSC è stato complicato come molti siti anatomici partecipare durante emopoiesi fetale. Recentemente, abbiamo identificato la placenta come organo principale ematopoietiche dove si generano HSCs e ampliato nel unici nicchie microambientali (Gekas, et al 2005, Rodi, et al 2008). Di conseguenza, la placenta è una fonte importante di cellule staminali durante il loro nascita e l'espansione iniziale.

In questo articolo, mostriamo le tecniche di dissezione per l'isolamento di murino placenta da 10,5 e E12.5 embrioni, corrispondenti alle fasi di sviluppo di iniziazione di cellule staminali e il picco nella dimensione del pool di HSC nella placenta, rispettivamente. Inoltre, presentiamo un protocollo ottimizzato per dissociazione enzimatica e meccanica del tessuto placentare in cella singola sospensione per l'uso in citometria a flusso o test funzionali. Abbiamo trovato che l'uso di collagenasi per cella singola sospensione della placenta dà rendimenti sufficiente di cellule staminali. Un fattore importante di rendimento HSC dalla placenta è il grado di dissociazione meccanica prima, e la durata di un trattamento enzimatico.

Forniamo anche un protocollo per la preparazione di fisso congelati sezioni di tessuto placentare per la visualizzazione di sviluppare HSCs mediante immunoistochimica nelle loro nicchie precise cellulare. Come ematopoietiche antigeni specifici non vengono mantenute durante la preparazione di sezioni in paraffina, si usano abitualmente fisso sezioni congelate per la localizzazione HSCs placentare e progenitori.

Protocol

1. Embrione rimozione e dissezione placentare Per cominciare, gli embrioni devono essere prima isolati da dighe incinta. Gli animali sono l'eutanasia secondo procedure approvate – nel nostro caso abbiamo intenzione di utilizzare una dose letale di anestetico isoflurano In primo luogo, spruzzare il ventre con etanolo e fare una piccola incisione con un paio di forbici. Strappare via la pelle con entrambe le mani per scoprire l'addome e tagliare aprire il peritoneo. <li…

Discussion

Le procedure sperimentali descritte in questo protocollo permetterà per l'isolamento e la visualizzazione del tessuto placentare e staminali ematopoietiche e cellule progenitrici. Per un riepilogo completo di rendimento atteso su cellulare e numero di cellule staminali nella placenta fetale e di altri organi ematopoietici durante lo sviluppo fetale si fa riferimento a Gekas, et al. 2005. Per la localizzazione di cellule staminali e lo sviluppo di altre cellule ematopoietiche nella placenta si fa riferimento a Rodi, et al. 2008.

Materials

Materials List:
100mM Glucose
10mM NaN3
15-ml conical tubes (BD)
16-G, 18-G, 20-G, 22-G and 25-G needles (BD)
30% Sucrose Solution
35mm Petri Dishes (BD)
4% Paraformaldehyde
50- m cell filters (Celltrics)
5-ml syringes (BD)
Alkaline Phosphatase Substrate Kit I (Vector Red, Vector)
Alkaline Phosphatase Substrate Kit III (Vector Blue, Vector)
Antibiotic (Penicillin/Streptomycin, P/S) solution
Collagenase type I (Sigma)
Cryomold Disposable Vinyl Specimen Molds (10mm x 10mm x 5 mm, Tissue-Tek)
Cytokeratin Primary Antibody (DakoCytomation)
Dissection forceps, stainless steel or titanium, number 5 or 55
Drierite
Fetal Bovine Serum (FBS)
Fisherbrand Plastic Microscope Slide Mailer (Fisher)
Glucose Oxidase 1000u/ml
Levamisole (Vector)
Mounting media, Aqueous-based Mounting Medium (VectamountTM AQ)
Normal Horse Serum (Vector)
Optimal Cutting Temperature (O.C.T., Tissue-Tek)
Peroxidase Substrate Kit DAB (Vector)
Phosphate Buffered Saline (PBS) with Calcium/Magnesium (w Ca2+/Mg2+)
Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium/Magnesium (w/o Ca2+/Mg2+)
Plastic Slide Box (holds 100 slides)
Plastic Tubing (Nalgene 180 PVC Non-toxic Autoclavable)
Polypropylene Round-Bottom Test Tube, 5 ml (12×75 mm, BD Falcon)
Proteinase K 20mg/ml Solution (Amresco)
Research Products International Corp Super Pap Pen HT* Slide Markers (2,5 mm, Fisher)
Tissue-culture treated U-shaped (round-bottom) 96-well or 24-well plates (BD Falcon)
Tween20, SigmaUltra (Sigma)
Tyramide Amplification Kit (Invitrogen)
Vectastain ABC Alkaline Phosphatase Standard Kit (Vector)
Vectastain ABC Standard Elite Kit (Vector)