Выделение и анализ гемопоэтических стволовых клеток из плаценты
Summary
Мы определили, как плацента основных кроветворных органов в процессе разработки. Мы обнаружили, что гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) являются как генерируется и расширен в плаценте в уникальных микроокружения ниши. Здесь мы опишем экспериментальные методы, необходимые для изоляции и визуализации в ГСК мыши плаценты.
Abstract
Гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) имеют возможность самостоятельно обновлять и создавать все типы клеток крови линий в течение всей жизни человека. Все ГСК возникают во время эмбрионального развития, после чего их размер пула поддерживается самообновлению клеточных делений. Определение анатомического происхождения ГСК и критического развития событий регулирующие процесс развития АПК было сложно, как много анатомических участвовать в период внутриутробного кроветворения. В последнее время мы выявили плаценты в качестве основной гемопоэтических орган, в котором ГСК генерируются и расширена в уникальной микроокружения ниши (Гекас, и др. 2005, Родос и др. 2008). Следовательно, плацента является важным источником ГСК во время их возникновения и начального развития.
В этой статье мы покажем рассечение методы для выделения мышиных плаценту от E10.5 и E12.5 эмбрионов, что соответствует стадии развития ГСК начала и пика в размере HSC бассейн в плаценту, соответственно. Кроме того, мы представляем оптимизированный протокол для ферментативной и механической диссоциации плацентарной ткани в одной клеточной суспензии для использования в проточной цитометрии или функционального анализа. Мы обнаружили, что использование коллагеназы для одно-клеточной суспензии плаценты дает достаточные выход ГСК. Важным фактором, влияющим на выход из HSC плацента степени механической диссоциации до, и продолжительность, ферментативную обработку.
Мы также предоставляем протокол для подготовки основных заморозки плацентарной ткани разделы для визуализации развития ГСК по иммуногистохимии в их точном сотовой ниши. Как гемопоэтические специфические антигены, не сохраняются в процессе приготовления парафиновых срезах, мы обычно используем фиксированный замороженных срезов для локализации плаценты ГСК и прародителей.
Protocol
Discussion
Экспериментальных процедур, описанных в данном протоколе позволит изоляции и визуализации плацентарной ткани и кроветворных стволовых и прогениторных клеток. Для всеобъемлющее резюме на ожидаемых сотовых выход и количество ГСК в плаценте и других эмбриональных кроветворных органов протяжени?…
Materials
Materials List:
100mM Glucose
10mM NaN3
15-ml conical tubes (BD)
16-G, 18-G, 20-G, 22-G and 25-G needles (BD)
30% Sucrose Solution
35mm Petri Dishes (BD)
4% Paraformaldehyde
50- m cell filters (Celltrics)
5-ml syringes (BD)
Alkaline Phosphatase Substrate Kit I (Vector Red, Vector)
Alkaline Phosphatase Substrate Kit III (Vector Blue, Vector)
Antibiotic (Penicillin/Streptomycin, P/S) solution
Collagenase type I (Sigma)
Cryomold Disposable Vinyl Specimen Molds (10mm x 10mm x 5 mm, Tissue-Tek)
Cytokeratin Primary Antibody (DakoCytomation)
Dissection forceps, stainless steel or titanium, number 5 or 55
Drierite
Fetal Bovine Serum (FBS)
Fisherbrand Plastic Microscope Slide Mailer (Fisher)
Glucose Oxidase 1000u/ml
Levamisole (Vector)
Mounting media, Aqueous-based Mounting Medium (VectamountTM AQ)
Normal Horse Serum (Vector)
Optimal Cutting Temperature (O.C.T., Tissue-Tek)
Peroxidase Substrate Kit DAB (Vector)
Phosphate Buffered Saline (PBS) with Calcium/Magnesium (w Ca2+/Mg2+)
Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium/Magnesium (w/o Ca2+/Mg2+)
Plastic Slide Box (holds 100 slides)
Plastic Tubing (Nalgene 180 PVC Non-toxic Autoclavable)
Polypropylene Round-Bottom Test Tube, 5 ml (12×75 mm, BD Falcon)
Proteinase K 20mg/ml Solution (Amresco)
Research Products International Corp Super Pap Pen HT* Slide Markers (2,5 mm, Fisher)
Tissue-culture treated U-shaped (round-bottom) 96-well or 24-well plates (BD Falcon)
Tween20, SigmaUltra (Sigma)
Tyramide Amplification Kit (Invitrogen)
Vectastain ABC Alkaline Phosphatase Standard Kit (Vector)
Vectastain ABC Standard Elite Kit (Vector)
References
- Gekas, C., Dieterlen-Lievre, F., Orkin, S. H., Mikkola, H. K. A. The placenta is a niche for hematopoietic stem cells. Dev Cell. 8, 365-375 (2005).
- Rhodes, K. E., Gekas, C., Wang, Y., Lux, C. T., Francis, C. S., Chan, D. N., Conway, S., Orkin, S. H., Yoder, M. C., Mikkola, H. K. A. The Emergence of Hematopoietic Stem Cells Is Initiated in the Placental Vasculature in the Absence of Circulation. Cell Stem Cell. 2, 252-263 (2008).
