In vitro-differentiering av Mouse embryonala stamceller (MES) celler med hängande släpp-metoden

Summary

Denna video visar hur du utföra in vitro-differentiering av mus-embryonala stamceller till embryoid organ med hängande släpp-metoden.

Abstract

Stamceller har den anmärkningsvärda potential att utvecklas till många olika celltyper. När en stamcell delar sig har varje ny cell potential att antingen förbli en stamcellstransplantation eller bli en annan typ av cell med en mer specialiserad funktion, är detta lovande vetenskapens ledande forskare att undersöka möjligheten av cellbaserade terapier för behandling av sjukdomen. När kultur i avstängning utan antidifferentiation faktorer, embryonala stamceller skiljer spontant och bildar tredimensionella flercelliga aggregat. Dessa cellaggregat kallas embryoid organ (EB). Droppe kultur är en allmänt använd EB bildandet induktion metod. Den rundade botten droppe tillåter aggregering av ES-celler som kan ge MES celler en god miljö för att bilda EBS. Antalet ES-celler aggregatied i en droppe kan kontrolleras genom att variera antalet celler i den inledande cellsuspension att hängas som en droppe från locket på en petriskål. Med denna metod kan vi reproducerbart bilda homogena EB från ett förutbestämt antal ES-celler.

Protocol

Gelatinize T75 kolven med hjälp av en 0,1% gelatin-lösning och inkubera plattan i 37 ° C, 5% CO 2 vävnadsodling inkubator natten en dag innan. Ta ut MES celler från inkubera, aspirera mediet, skölj kultur ES-celler med PBS, lägg till 0,05% trypsin lösning att belägga botten av skålen (2 ml/100mm tallrik). Inkubera vid 37 ° C i ca 1 minut, tills cellerna avskedandet plattan. Försiktigt mal sönder (Pipettera upp och ner) den trypsinized celler fyra till sex gånger för att skin…

Discussion

Nackdelarna med hängande släpp-metoden är följande: den flytande volym av en droppe är begränsad till mindre än 50ul grund för att upprätthålla hänger droppar på locket genom ytspänning, och det är omöjligt att ändra medium för hängande droppar. Observation bilda strandsandaler droppar direkt med mikroskopi är också mycket svårt under odlingen. Vidare består droppe metoden i två steg, därför kan ett antal steg i droppe metoden vara besvärande.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
DMEM	Reagent	Gibco	11965-092
Fetal Bovine Serum(FBS)	Reagent	Hyclone	SH30070.03
L-Glutamine	Reagent	Gibco	25030
Non-Essential Amino Acids	Reagent	Gibco	11140-050
Penicllin / Streptomycin	Reagent	Gibco	15140-122
Sodium Pyruvate	Reagent	Gibco	11360-70
β-mercaptoethanol	Reagent	Chemicon	ES-007-E
leukemia inhibitory factor(LIF)	Reagent	Chemicon	LIF2005
96-well ultralow attachment plate	Tool	Corning	3474