Denna video visar hur att upprätthålla tillväxten av stamceller från mänskliga embryon (hESCs) i mataren cellfria villkor och hur man kontinuerligt passage hESCs i mataren cellfria förhållanden. Bekräftelse av hESC pluripotens odlas i mataren cellfria förhållanden genom immunofluorescens mikroskopi är också påvisas. Del 2 av 3.
Abstract
Denna video visar hur man odlar stamceller från mänskliga embryon (hESCs) på musens embryonala fibroblaster (MEF) feeder celler, hur man passage hESCs från MEF plattor till feeder cellfria Matrigel plattor.
Protocol
hESC kultur dagligt underhåll hESC odlingsmedia måste bytas var 24 timmar. Från ES media lager flaska förvaras vid 4 ° C, ta ut den mängd lösning som krävs (~ 20 ml per 6-brunnar) och placera i en 50ml falk rör, och värm till 37 ° C i ett vattenbad. När media är varm, lägg bFGF lagras vid 4 ° C till en slutlig koncentration av 10ng/ml. Sätt bFGF beståndet tillbaka vid 4 ° C omedelbart efter användning! Ta bort från 6-brunnars plattor alla utom ~ 500μl av media. Se till att snurr…
Discussion
Denna video visar hur du passage hESCs från MEF plattor till feeder cellfria Matrigel plattor. Observera att kolonin densitet på Matrigel är högre än tätheten av kolonierna av vanliga dela på MEFs. Immunofluorescens färgning och mikroskopi eller flödescytometri för hESC pluripotens markörer, såsom oktober-4 och SSEA-4, behövs för att bekräfta underhåll av hESCs i en odifferentierad stat i feeder-fri kultur villkor.
Acknowledgements
Mänskliga embryonala stamceller studier i Teitell labbet stöds av en California Institute för regenerativ medicin (CIRM) frö bevilja RS1-00.313. Vi tackar medlemmar i de allmänna Centrum för regenerativ medicin och stamcellsforskning vid UCLA, speciellt Dr Amander Clark, Dr Jerome Zack, och medlemmar av UCLA Broad Institute Stem Cell Core Facility för deras stöd för våra studier.
Thomson, J. a. m. e. s. A., Itskovitz-Eldor, J. o. s. e. p. h., Shapiro, S. a. n. d. e. r. S., Waknitz, M. i. c. h. e. l. l. e. A., Swiergiel, J. e. n. n. i. f. e. r. J., Marshall, V. i. v. i. e. n. n. e. S., Jones, J. e. f. f. r. e. y. M. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts .Science. 282, 1145-1147 (1998).
Xu, C. h. u. n. h. u. i., Inokuma, M. a. r. g. a. r. e. t. S., Denham, J. e. r. r. o. d., Golds, K. a. t. h. a. l. e. e. n., Kundu, P. r. a. t. i. m. a., Gold, J. o. s. e. p. h. D., Carpenter, M. e. l. i. s. s. a. K. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).
Khvorostov, I., Zhang, J., Teitell, M. From MEFs to Matrigel 2: Splitting hESCs from MEFs onto Matrigel. J. Vis. Exp. (16), e831, doi:10.3791/831 (2008).