Från MEFs till Matrigel 3: Passaging hESCs från Matrigel på Matrigel
Summary
Denna video visar hur att upprätthålla tillväxten av stamceller från mänskliga embryon (hESCs) i mataren cellfria villkor och hur man kontinuerligt passage hESCs i mataren cellfria förhållanden. Bekräftelse av hESC pluripotens odlas i mataren cellfria förhållanden genom immunofluorescens mikroskopi är också påvisas. Del 3 av 3.
Abstract
Denna video visar hur att upprätthålla tillväxten av stamceller från mänskliga embryon (hESCs) i mataren cellfria villkor och hur man kontinuerligt passage hESCs i mataren cellfria förhållanden. Bekräftelse av hESC pluripotens odlas i mataren cellfria förhållanden genom immunofluorescens mikroskopi är också påvisas.
Protocol
Discussion
Denna serie av tre filmer visar hur man odlar stamceller från mänskliga embryon (hESCs) på musens embryonala fibroblaster (MEF) feeder celler (video 1), hur man passagen dem att Matrigel feeder cellfria plattor (video 2) och hur man underhåller hESCs av passaging i Matrigel mataren cellfria villkor (video 3). Ett flertal tidigare studier visade att underhåll av livskraftiga, odifferentierad hESCs kräver kultur på inaktiverade celler MEF matare. Men för många experiment, är en ren population av hESCs gratis feeder cell föroreninga…
Acknowledgements
Mänskliga embryonala stamceller studier i Teitell labbet stöds av en California Institute för regenerativ medicin (CIRM) frö bevilja RS1-00.313. Vi tackar medlemmar i de allmänna Centrum för regenerativ medicin och stamcellsforskning vid UCLA, speciellt Dr Amander Clark, Dr Jerome Zack, och medlemmar av UCLA Broad Institute Stem Cell Core Facility för deras stöd för våra studier.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Knockout Serum Replacer (KSR) | Reagent | Gibco | 10828-028 | |
| DMEM/F12 | Reagent | Gibco | 11330-057 | |
| Non-essential Amino Acids | Reagent | Gibco | 11140-050 | |
| GlutaMax | Reagent | Gibco | 35050-061 | |
| DMEM | Reagent | Gibco | 11995-065 | |
| FBS | Reagent | Clontech | 631107 | |
| L-glutamine | Reagent | Gibco | 25030-081 | |
| BME | Reagent | Fisher | BP176-100 | |
| bFGF | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Collagenase IV | Reagent | Gibco | 17104-019 | |
| Dispase | Reagent | Stem Cell Technologies | 17105-041 | |
| Penicillin / Streptomycin | Reagent | Gibco | 15140-122 | |
| Gelatin | Reagent | Chemicon | ES-006-B | |
| Matrigel | Reagent | BD Biosciences | 354277 | |
| Oct-4 antibody | Reagent | Santa Cruz Biotechnology | SC-9081 | |
| anti-h/mSSEA-4 Phycoerythrin Conjugated Mouse IgG3 | Reagent | R&D Systems | FAB1435P | |
| FITCI-conjugated antirabbit IgG | Reagent | Jackson ImmunoResearch Laboratories. Inc. | 715-095-152 |
References
- Thomson, J. a. m. e. s. A., Itskovitz-Eldor, J. o. s. e. p. h., Shapiro, S. a. n. d. e. r. S., Waknitz, M. i. c. h. e. l. l. e. A., Swiergiel, J. e. n. n. i. f. e. r. J., Marshall, V. i. v. i. e. n. n. e. S., Jones, J. e. f. f. r. e. y. M. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts . Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Xu, C. h. u. n. h. u. i., Inokuma, M. a. r. g. a. r. e. t. S., Denham, J. e. r. r. o. d., Golds, K. a. t. h. a. l. e. e. n., Kundu, P. r. a. t. i. m. a., Gold, J. o. s. e. p. h. D., Carpenter, M. e. l. i. s. s. a. K. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells Nature Biotechnology 19. Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).
