이 동영상은 파킨슨병에 대한 모델로 dopaminergic 신경 세포의 neurodegeneration을 평가 C. 엘레간스를 사용하는 방법을 보여줍니다. 또한, 유전자 화면은 어느 변성을 향상 또는 neuroprotective 가지 요인을 식별하는 데 사용됩니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
파킨슨병 (PD)의 진단과 치료에 개선이 위험 인구를 렌더링 자화율 요인에 대한 지식에 의존하고 있습니다. 경찰과 관련된 새로운 유전자 요소를 식별하는 시도의 과정에서, 과학자들은 후보 유전자, polymorphisms, 중요한 진보를 대표하는 단백질의 많은 목록을 생성 있지만, 이러한 리드 mechanistically 정의되지 않은 상태로 유지됩니다. 우리 작품은 상당히 간단한 동물 모델 시스템의 장점을 이용하여 이러한 목록을 축소 방향으로 목표로하고 있습니다. 인간 뉴런 수십억을 가지고 있지만, 미세한 회 Caenorhabditis 엘레간스 정확하게 302을 가지고있는 hemaphrodites에서 단지 8 생산의 도파민 (DA). 투약 및 연령에 의존 neurodegeneration에 C. 엘레간스 DA 뉴런 결과에서 PD - 관련 단백질, 알파 synuclein를 인코딩 인간 유전자의 표현.
DA의 뉴런 인간의 알파 synuclein을 표현하는 벌레는 isogenic하고 검찰의 전송 모터 (Pdat - 1)에서 GFP과 인간 알파 synuclein 모두를 표현한다. GFP의 존재이 동물에서 검찰의 neurodegeneration에 따라위한 쉽게 시각 마커 역할을합니다. 우리는 처음 알파 synuclein 유발 검찰 neurodegeneration가 torsinA, 분자 보호자 활동 1 단백질 이러한 동물 구출 수 있다고 보여주었다. 또한, 후보 PD 관련 유전자 그러면 C. 엘레간스 DA 뉴런의 과잉 표현했다 알파 synuclein의 misfolding 분석을 사용하여 대규모 RNAi 심사 노력을 통해 우리가 실험실에서 발견. 우리는 그들이 알파 synuclein - 유발 - DA neurodegeneration 2 구조로 다섯 일곱 유전자 PD의 대표 중요한 후보 변조기를 테스트 사실을 확인했습니다. 알파 synuclein에 의존 독성이 세포 독성을 강화하거나 억제 유전자에 대한 수 판독로 사용됩니다 의하여 또한, 린드 퀴 스트 연구소 (목성의 문제) 효모 화면을 수행했습니다. 우리는 이후의 C. 엘레간스 알파 synuclein - 유도 neurodegeneration 분석에 효모 후보 유전자 검사를하고 성공적으로 이러한 목표를 3, 4의 많은 검증.
우리의 방법론은 Pdat - 1 프로 모터의 제어하에 후보 유전자 cDNAs의 recombinational 복제를 사용하는 C. 엘레간스 DA 뉴런 특정 발현 벡터의 생성을 포함한다. 이러한 plasmids 그러면 성공적인 변환을위한 선택 마커와 함께 야생 타입 (N2) 벌레에 microinjected 있습니다. DA의 뉴런에서 후보 단백질을 생산하는 다수의 안정적인 유전자 변형 라인은 노화의 과정을 통해, 동물 및 개별 신경 세포 수준 모두에서, 취득 후 독립적으로 건너 알파 synuclein 퇴행성 변형에와 neurodegeneration에 대한 평가입니다.
프로토콜
A. 식 플라스미드 건설
두 plasmids이 필요합니다 : 조직 특정 관심의 유전자의 표현과 선택 전환 표시로 두 번째 (플라스미드 마커가 연구 공동체에서 일반적으로 사용할 수 있습니다하지만) 한.
실험 플라스미드
- 관심 조직 / 세포 유형에 표현되는 모터를 선택,이 경우, 검사의 수송은 (Pdat - 1) 발기인이 사용됩니다. 이 표현 플라스미드는 복제 recombinational 1 모터 관심 하류의 유전자의 삽입을 허용하는 Invitrogen 게이트웨이 시스템을 호환 대상 벡터 (pDEST - DAT - 1)로 만들어졌습니다.
- 관심 유전자의 cDNA는 PCR이 게이트웨이 AT & T B recombinational 시퀀스를 포함하는 primers를 사용하여 증폭됩니다. 증폭된 cDNA 먼저 입력 벡터를 만들 수있는 기증자 벡터 pDONR201에 recombined 후 E. 대장균 DH5α 변형으로 변환됩니다. 성공 recombinants과 DNA의 미니 준비 고립의 선택에 따라, 입력 벡터는 표현식이 플라스미드 만들 pDEST - DAT - 1 대상 벡터에 recombined입니다. recombinational 복제에 대한 자세한 ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
도파민 뉴런의 나이에 의존 손실이 파킨슨병의 임상적 특징이며 알파 synuclein이라는 단백질의 축적이나 misfolding와 연결되었습니다. 여기 C.의 dopaminergic 신경, 형광등 transgene을 통해, 레이블하는 방법을 보여줍니다 엘레간스 이러한 세포의 coexpressing 인간 알파 synuclein에 의해 파킨슨병에서 본 neurodegeneration을 모방.
이 동영상은 성장, 유전자 교차점, 장착 및 중 neurodegeneration을 강화하거나 노화의 과정을 통해 neuroprotection을 제공 유전 요인을 평가하기 위해 유전자 변형 nematodes의 점수에 대한 방법론을 묘사. 관리가 적절하게 신경 세포의 손실이나 보호를 채점에서 남성과 성공 유전자 교차하기 위해 나온것 개최하고, 일관성 유지를 위해 transgene 마커를 사용하여 촬영합니다. 이러한 방법으로, C. 엘레간스도 neurodegeneration에 기여하거나 향상시키는 신경 세포의 생존을 위해 치.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
감사의 글
우리 모두는 콜드 웰 연구소 회원의 협력 정신을 인정하고 싶습니다. 연구실에 운동 장애 연구는 바흐만 - 스트라우스 Dystonia & 파킨슨병 재단, 미국 파킨슨병 재단, 미국 파킨슨 질병 협회, 앨라배마 파킨슨병 협회, 파킨슨병 연구에 대한 마이클 J. 폭스 재단과 대학 연구소에 의해 지원되었습니다
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 | |
|---|---|---|---|---|
| 아가로스(Agarose) | 초순수(Ultrapure) | Invitrogen | 15510-027 | |
| 커버글라스 20x30 mm | Fisher Scientific | 12-548-5A | ||
| 현미경 슬라이드 | Plain, 3x1" | Fisher Scientific | 12-549 | |
| 형광 해부 | 현미경 | Nikon Instruments | SMZ800 | |
| 해부 | 현미경 | Nikon Instruments | SMZ645 | |
| 에피형광 | 현미경 | Nikon Instruments | Model E-800 | |
| 필터 큐브, GFP HYQ | Endow Bandpass | Chroma Technology Corp. |
참고문헌
- Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans. J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).
- Hamamichi, S., Rivas, R. N., Knight, A. L., Cao, S., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
