Paradigm för farmakologisk karakteristik av C. elegans synaptisk transmission Mutants
Summary
Denna video visar hur du anställa två neurala stimulantia, aldikarb och pentylenetetrazol (PTZ), kompletterande sätt att studera synaptisk funktion i nematoden, C. elegans. Det komplementära tillvägagångssättet kan också användas för att belysa evolutionärt bevarat mekanismer för modulerande neuronala synkroni och har betydelse för epilepsi och kramper.
Abstract
Den nematod, Caenorhabditis elegans, har blivit ett ändamålsenligt modell för att studera neurotransmission. C. elegans är unik bland djurmodeller, som anatomi och anslutning av sitt nervsystem har fastställts från elektron micrographs och förfinats med hjälp av farmakologiska analyser. I denna video beskriver vi hur två kompletterande neurala stimulantia, en acetylkolinesterashämmare, kallad aldikarb och en gammaaminosmörsyra (GABA) receptorantagonist, som kallas pentylenetetrazol (PTZ) kan användas för att specifikt karaktärisera signalering i C. elegans neuromuskulära korsningar (NMJs) och underlätta vår förståelse av antagonistiska neurala kretsar.
Av 302 C. elegans nervceller, nitton GABAergic D-typ motoriska nervceller innerverar kroppen väggen muskler (BWMs), medan fyra GABAergic nervceller, som kallas RMEs, innerverar huvudet muskler. Omvänt 39 motoriska nervceller uttrycka den excitatoriska neurotransmittorn, acetylkolin (ACh) och motverka GABA överföring på BWMs att samordna förflyttning. Den antagonistiska karaktären av GABAergic och kolinerga motoriska nervceller i kroppen väggen NMJs ursprungligen fastställdes med laser ablation och senare understödda av aldikarb exponering. Akut aldikarb exponering resulterar i en tid-kurs eller dos-lyhörd förlamning i vildtyp maskar. Ändå ger förlust av excitatoriska ACh överföring motstånd mot aldikarb, som mindre ACh ackumuleras på mask NMJs, vilket leder till mindre stimulering av BWMs. Resistens mot aldikarb kan ses med ACH-specifik eller allmän synapsfunktionen mutanter. I överensstämmelse med antagonistiska GABA och ACH överföring, förlust av GABA överföring, eller underlåtenhet att negativ reglera ACh versionen ger överkänslighet mot aldikarb. Även aldikarb exponering har lett till isolering av många masken homologer av neurotransmission gener, aldikarb exponering inte ensam kan effektivt avgöra rådande roller för gener och vägar i specifika C. elegans motoriska nervceller. För detta ändamål har vi infört en kompletterande experimentell metod, som använder PTZ.
Neurotransmission mutanter uppvisar tydliga fenotyper, till skillnad från aldikarb-inducerad förlamning, som svar på PTZ. Vildtyp maskar, liksom mutanter med specifika oförmåga att frigöra eller ta emot Ach, visar inte uppenbar känslighet för PTZ. Men GABA mutanter, samt allmän synaptisk mutanter funktion, visa främre kramper i en tid-kurs eller dos-lyhörd sätt. Mutanter som inte kan negativt reglerar generella neurotransmittor utsläpp och därmed utsöndrar stora mängder ACh på BWMs, blivit förlamad på PTZ. PTZ-inducerad fenotyper av diskreta mutant klasser visar att ett komplement med aldikarb och PTZ paradigm exponering i C. elegans kan accelerera vår förståelse av neurotransmission. Dessutom bör videor som visar hur vi presterar farmakologiska analyser fastställa enhetliga metoder för C. elegans forskning.
Protocol
Discussion
Aktuella protokoll för aldikarb exponering med C. elegans tillåter inte praktiker att skilja mellan mutanter med specifika brister i ACh överföring och mutanter med generaliserad underskott i synaptisk transmission, eftersom båda klasserna av mutanter uppvisar resistens mot aldikarb. På samma sätt kan aldikarb inte användas för att avgöra om mutanter har specifika brister i GABA överföring eller generaliserad fel att negativt reglera ACh överföring, eftersom båda klasserna av mutanter uppvisar överkänslighet mot al…
Acknowledgements
Vi vill erkänna den kooperativa andan i alla Caldwell Lab medlemmar. En Basil O'Connor Scholar Award från March of Dimes och en karriär utmärkelse från National Science Foundation för att GAC, samt en Grundutbildning Forskning Science Program Bidrag från Howard Hughes Medical Institute på University of Alabama, har finansierat neuronala retbarhet och epilepsi forskning i Caldwell Lab.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Aldicarb | Reagent | Supelco, Inc. | PS734 | Purchasable from Sigma |
| Pentylenetetrazole | Reagent | Sigma | P6500 |
References
- Mahoney, T. R., Luo, S., Nonet, M. L. Analysis of synaptic transmission in Caenorhabditis elegans using an aldicarb-sensitivity assay. Nat. Protoc. 1, 1772-1777 (2006).
- Williams, S. N., Locke, C. J., Braden, A. L., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Epileptic-like convulsions associated with LIS-1 in the cytoskeletal control of neurotransmitter signaling in Caenorhabditis elegans. Hum. Mol. Genet.. 13, 2043-2059 (2004).
