Paradigmas para Caracterização farmacológica de C. elegans Mutants Transmissão Sináptica
Summary
Este vídeo demonstra como empregar dois estimulantes neural, aldicarb e pentilenotetrazol (PTZ), de forma complementar para estudar a função sináptica no nematóide, C. elegans. Esta abordagem complementar também podem ser usados para lançar luz sobre mecanismos evolutivamente conservados para sincronia neuronal modular e tem implicações para a epilepsia e convulsões.
Abstract
O nematóide, Caenorhabditis elegans, tornou-se um modelo conveniente para estudar a neurotransmissão. C. elegans é único entre os modelos animais, como a anatomia e conectividade de seu sistema nervoso foi determinada a partir de micrografias eletrônicas e refinado por ensaios farmacológicos. Neste vídeo, descrevemos como dois complementares estimulantes neural, um inibidor da acetilcolinesterase, chamado aldicarbe, e um ácido gama-aminobutírico (GABA) antagonista do receptor, chamado de pentilenotetrazol (PTZ), pode ser empregada para caracterizar especificamente sinalização em C. elegans junções neuromusculares (NMJs) e facilitar nossa compreensão da antagônicas circuitos neurais.
De 302 C. elegans neurônios, dezenove neurônios GABAérgicos D-tipo do motor corpo inervam os músculos da parede (BWMs), enquanto quatro neurônios GABAérgicos, chamado RMEs, músculos da cabeça inervam. Por outro lado, os neurônios do motor 39 expressar o neurotransmissor excitatório, a acetilcolina (ACh), e antagonizar a transmissão GABA em BWMs para coordenar a locomoção. A natureza antagônica dos neurônios motores GABAérgicos e colinérgicos em corpo NMJs parede foi inicialmente determinada por ablação a laser e, mais tarde reforçada pela exposição aldicarbe. Resultados aldicarbe aguda de exposição em uma paralisia tempo-curso ou dose-resposta no tipo selvagem worms. No entanto, a perda de transmissão ACh excitatórios confere resistência ao aldicarb, como ACh menos acumula em NMJs worm, levando a uma menor estimulação da BWMs. Resistência ao aldicarb pode ser observado com ACh-específicas ou gerais mutantes função sináptica. Consistente com GABA antagônicas e transmissão de ACh, a perda de transmissão GABA, ou uma falta de regular negativamente ACh lançamento, confere hipersensibilidade ao aldicarbe. Embora a exposição aldicarbe levou ao isolamento de vírus homólogos numerosos genes de neurotransmissão, a exposição aldicarbe por si só não pode determinar de forma eficiente papéis predominantes para os genes e as vias de neurônios específicos C. elegans motor. Para esse fim, introduzimos uma abordagem complementar experimental, que usa PTZ.
Mutantes neurotransmissão exibir fenótipos clara, distinta de aldicarbe induzida por paralisia, em resposta a PTZ. Do tipo selvagem worms, bem como os mutantes com incapacidades específicas para liberar ou receber ACh, não mostram sensibilidade aparente para PTZ. No entanto, os mutantes GABA, bem como em geral os mutantes função sináptica, display convulsões anterior de uma maneira tempo-curso ou dose-resposta. Mutantes que não podem regular negativamente a liberação do neurotransmissor em geral e, assim, secretam quantidades excessivas de ACh em BWMs, tornam-se paralisado em PTZ. Os fenótipos PTZ-induzida de discreta aulas mutante indicam que uma abordagem complementar com aldicarb e paradigmas exposição PTZ em C. elegans pode acelerar nossa compreensão da neurotransmissão. Além disso, vídeos demonstrando como realizamos os ensaios farmacológicos devem estabelecer métodos consistentes para C. elegans pesquisa.
Protocol
Discussion
Os protocolos atuais para a exposição com aldicarb C. elegans não permitem que pesquisadores a distinguir entre mutantes com déficits específicos de ACh transmissão e mutantes com déficits generalizados na transmissão sináptica, como ambas as classes de mutantes apresentam resistência ao aldicarbe. Da mesma forma, aldicarbe não pode ser usado para determinar se os mutantes têm déficits específicos na transmissão GABA ou falhas generalizadas para regular negativamente ACh transmissão, como ambas as classes de mutante…
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer o espírito cooperativo de todos os membros Caldwell Lab. A Basil O'Connor Scholar Award da March of Dimes e uma concessão de CARREIRA do National Science Foundation para GAC, bem como uma Bolsa de Investigação Graduação Programa de Ciência da Howard Hughes Medical Institute para a Universidade do Alabama, ter financiado a excitabilidade neuronal e pesquisa da epilepsia no Laboratório de Caldwell.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Aldicarb | Reagent | Supelco, Inc. | PS734 | Purchasable from Sigma |
| Pentylenetetrazole | Reagent | Sigma | P6500 |
References
- Mahoney, T. R., Luo, S., Nonet, M. L. Analysis of synaptic transmission in Caenorhabditis elegans using an aldicarb-sensitivity assay. Nat. Protoc. 1, 1772-1777 (2006).
- Williams, S. N., Locke, C. J., Braden, A. L., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Epileptic-like convulsions associated with LIS-1 in the cytoskeletal control of neurotransmitter signaling in Caenorhabditis elegans. Hum. Mol. Genet.. 13, 2043-2059 (2004).
