Paradigmi per la caratterizzazione farmacologica di C. elegans Mutanti trasmissione sinaptica

Summary

Questo video dimostra come utilizzare due stimolanti neurali, aldicarb e pentylenetetrazole (PTZ), in modo complementare per studiare la funzione sinaptica nel nematode, C. elegans. Questo approccio complementare può essere utilizzato anche per far luce sui meccanismi evolutivamente conservata per modulare la sincronia dei neuroni e ha implicazioni per l'epilessia e convulsioni.

Abstract

Il nematode, Caenorhabditis elegans, è diventato un modello utile per lo studio di neurotrasmissione. C. elegans è unico tra i modelli animali, come l'anatomia e la connettività del suo sistema nervoso è stata determinata dal microscopio elettronico e raffinato da saggi farmacologici. In questo video viene descritto come due stimolanti complementari neurali, un inibitore dell'acetilcolinesterasi, chiamato aldicarb, e un acido gamma-aminobutirrico (GABA), antagonista dei recettori, chiamati pentylenetetrazole (PTZ), possono essere impiegate per caratterizzare specificamente segnalazione a C. elegans giunzioni neuromuscolari (NMJs) e facilitare la nostra comprensione di antagoniste circuiti neurali.

C. elegans di 302 neuroni, diciannove GABAergici di tipo D motoneuroni innervano i muscoli del corpo a parete (BWMs), mentre quattro neuroni GABAergici, chiamato RMEs, testa innervano i muscoli. Al contrario, 39 motoneuroni esprimere il neurotrasmettitore eccitatorio, l'acetilcolina (ACh), e antagonizzano la trasmissione GABA a BWMs per coordinare locomozione. La natura antagonista dei neuroni colinergici e GABAergici motore a corpo NMJs muro è stato inizialmente determinato da ablazione laser e poi sostenuta da esposizione aldicarb. Di esposizione acuta risultati aldicarb in una paralisi tempo portate o dose-risposta in wild-type vermi. Tuttavia, la perdita di trasmissione eccitatoria ACh conferisce resistenza agli aldicarb, come meno ACh si accumula a NMJs verme, portando a meno di stimolazione BWMs. Resistenza alla aldicarb può essere osservata con ACh-specifico o generale mutanti funzione sinaptica. Coerentemente con antagonisti GABA e ACh trasmissione, perdita di trasmissione GABA, o la mancata regolare negativamente ACh rilascio, conferisce ipersensibilità al aldicarb. Sebbene l'esposizione aldicarb ha portato all'isolamento di omologhi verme numerosi geni neurotrasmissione, l'esposizione aldicarb da sola non può determinare in modo efficiente ruoli prevalente per i geni e sulle vie di specifiche C. elegans motoneuroni. A questo scopo, abbiamo introdotto un approccio complementare sperimentale, che utilizza PTZ.

Mutanti neurotrasmissione visualizzare fenotipi chiaro, distinto da aldicarb indotta paralisi, in risposta alle PTZ. Wild-type worm, così come mutanti con specifiche incapacità di rilasciare o ricevere ACh, non mostrano sensibilità apparente PTZ. Tuttavia, mutanti GABA, così come generale mutanti funzione sinaptica, display convulsioni anteriore in modo tempo-corso o dose-risposta. Mutanti che non possono negativamente regolano il rilascio dei neurotrasmettitori generale e, quindi, secernono quantità eccessive di ACh su BWMs, diventano paralizzati su PTZ. Il PTZ-indotta fenotipi di discrete classi mutanti indicano che un approccio complementare con aldicarb e paradigmi esposizione PTZ in C. elegans possono accelerare la nostra comprensione della neurotrasmissione. Inoltre, i video che dimostrano come si eseguono i test farmacologici dovrebbero stabilire metodi coerenti per la ricerca C. elegans.

Protocol

Aldicarb esposizione Paradigm Il primo giorno, in modo che almeno trenta giovani vermi adulti fase di ogni genotipo e di ogni replica sarà disponibile per saggi aldicarb il secondo giorno. E 'meglio se uno sperimentatore seleziona cinquanta o più vermi stadio L4 su piastre NGM fresco (meglio senza nistatina), che contengono E. coli (preferibilmente OP50) come fonte di cibo, e farle crescere per 12-24 ore ad una temperatura costante e permissiva (20 ° C a 22 ° C è meglio, anche se 25 ° C va …

Discussion

Attuali protocolli per l'esposizione aldicarb con C. elegans sperimentatori non permettono di distinguere tra mutanti con deficit specifici nella trasmissione ACh e mutanti con un deficit generalizzato nella trasmissione sinaptica, in quanto entrambe le classi di mutanti mostrano resistenza al aldicarb. Allo stesso modo, aldicarb non può essere utilizzata per determinare se i mutanti hanno deficit specifici nella trasmissione GABA o fallimenti generalizzati di regolare negativamente ACh trasmissione, in quanto entrambe le clas…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Aldicarb	Reagent	Supelco, Inc.	PS734	Purchasable from Sigma
Pentylenetetrazole	Reagent	Sigma	P6500