SDD-AGE är en användbar teknik för upptäckt och karakterisering av amyloid-liknande polymerer i celler. Här visar vi en anpassning som gör att denna teknik lämpar sig för storskaliga tillämpningar.
Amyloid aggregering är förknippad med många sjukdomar proteiners ansamling och ligger bakom infektiösa egenskaper prioner, som är conformationally själv-mallhantering proteiner som tros ha positiva roller hos lägre organismer. Amyloid har notoriskt svårt att studera på grund av sin olöslighet och strukturella heterogenitet. Dock har upplösning av amyloid polymerer baserade på storlek och diskmedel olöslighet gjorts möjligt genom Semi-Denaturering Tvättmedel-agarosgelelektrofores (SDD-AGE). Denna teknik är att hitta utbredd användning för upptäckt och karakterisering av amyloid konformationsanalys varianter. Här visar vi en anpassning av denna teknik som underlättar dess användning i storskaliga tillämpningar, såsom skärmar för nya prioner och andra amyloidogenic proteiner. Det nya SDD-AGE-metoden använder kapillär överföring för större tillförlitlighet och användarvänlighet, och låter alla storlekar gelen skall förvaras. Således kan ett stort antal prover, som framställts av celler eller renade proteiner, behandlas samtidigt för förekomst av SDS-olösliga conformers av taggade proteiner.
SDD-AGE först rapporterades av Kryndushkin et al. 1, för att studera SDS-resistenta komplex av [PSI +] prion i jäst, och har sedan funnit en bred användning studera både prioner och andra prion aggregat 2-9. Det är dock överföring av proteiner till ett membran efter elektrofores på en agarosgel problematiska, och kan resultera i en förvrängd blot bild 5. Dessutom introducerar nedsänkt electroblotting teknik som används mest praktiska begränsningar för storleken på gelen och därmed antalet prover som kan behandlas. Vi har tagit upp dessa problem genom att anställa nedåt kapillär överföra 10, en enkel procedur som använder en bunt torrt gråpapper att överföra proteiner från gelen till ett nitrocellulosa membran. Kapillär överföra förhindrar distorsion och tillåter stora geler som ska behandlas enkelt. Det finns några saker att tänka på innan du använder SDD-AGE. För rå prover (t.ex. lysates) är immunodetection av specifika proteiner som behövs. SDD-AGE inte fullt denaturera proteinkomplex av intresse, så det protein (er) som skall detekteras måste bära en epitop tagg utanför amyloidogenic regionen. Lysates kan generellt förberedda som de skulle vara för en normal SDS-PAGE, med två viktiga skillnader. Först måste en ökad försiktighet iakttas för att förhindra nedbrytning av proteolys. Den delvis denaturering villkor används här inte är tillräckliga för att inaktivera proteaser, och kan också göra målproteiner mer mottagliga för proteolys. Använd en komplett cocktail proteashämmare vid minst två gånger den rekommenderade koncentrationen. För det andra, uppvärmning av prover bör undvikas. Om en all-monomer negativ kontroll önskas, t.ex. för att bekräfta att med hög molekylvikt arter är inte på grund av kovalenta modifieringar, en 10-minuters inkubation vid 95 ° C kan användas, vilket kommer att återställa de flesta amyloid till monomera protein.
Vi tackar Simon Alberti för hjälp med att utveckla detta protokoll. Detta arbete stöddes av ett bidrag från National Institutes of Health (GM25874), en Howard Hughes Medical Institute Investigatorship (SL), och en National Science Foundation predoctoral utbildning bidrag (till RH).
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
zymolyase 100T | Seikagaku America | 120493-1 | ||
Halt Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 78429 | ||
Hybond-C extra nitrocellulose | Amersham | RPN303E | ||
GB004 blotting paper | Whatman | 10427926 | ||
GB002 (3MM Chr) blotting paper | Whatman | 3030-917 | ||
Agarose (UltraPure) | Invitrogen | 15510-027 |