Démonstration technique de l'hybridation tableau Whole Genome génomique comparative
Summary
Cette vidéo est une démonstration technique du protocole d'hybridation pour l'ensemble du génome de carrelage CGH array chemin, qui scanne l'ensemble du génome humain en utilisant seulement 25 à 100 ng d'ADN qui peuvent être isolées à partir de diverses sources, y compris les archives du matériel fixé au formol.
Abstract
Hybridation génomique comparative (CGH array) est une méthode pour détecter les gains et pertes de segments d'ADN ou le dosage des gènes dans le génome 1. Les avancées récentes dans cette technologie ont permis de comparaison haute résolution des génomes entiers pour l'identification d'altérations génétiques dans le cancer et autres maladies génétiques 2. Le Sous-Megabase Résolution Carrelage-set tableau (ou SMRT) tableau est composé d'un ensemble d'environ trente mille bactéries qui se chevauchent chromosomes artificiels (BAC) des clones qui couvrent le génome humain en ~ 100 paires kilobases (kb) des segments 2. Ces cibles d'alcoolémie sont individuellement synthétisés et repéré en double sur une lame de verre simple 2-4. CGH array est basé sur le principe de l'hybridation compétitive. Des échantillons et l'ADN de référence sont étiquetés avec différentiel Cyanine-3 et colorants de cyanine-5 fluorescentes, et co-hybride à la matrice. Après une période d'incubation de l'échantillon non liés sont lavés de la diapositive et le tableau est imagé. Un logiciel librement disponible personnalisé appelé SeeGH (www.flintbox.ca) est utilisé pour traiter l'important volume de données recueillies – une expérience unique génère 53 892 points de données. SeeGH visualise le ratio d'intensité de signal entre le log2 2 échantillons à chaque cible d'alcoolémie qui est aligné verticalement avec la position chromosomique 5,6. Le tableau SMRT peut détecter des altérations aussi petite que 50 kb 7. Le tableau SMRT peut détecter une variété d'événements réarrangement d'ADN y compris les gains d'ADN, des pertes, des amplifications et délétions homozygotes. Un avantage unique de la matrice de SMRT est que l'on peut utiliser l'ADN isolé à partir d'échantillons de paraffine fixés au formol embarqués. Lorsqu'il est combiné avec les exigences d'entrée faible de l'ADN non amplifié (25-100 ng) ce qui permet le profilage des échantillons précieux tels que ceux produits par microdissection 7,8. Ceci est attribué à la grande taille de chacune des cibles hybridation BAC, qui permet la liaison de suffisamment d'échantillons étiquetés pour produire des signaux pour la détection. Un autre avantage de cette plateforme est la tolérance de l'hétérogénéité des tissus, en diminuant le besoin de microdissection tissulaire fastidieuse 8. Ce protocole est un tutoriel vidéo étape par étape, de marquage de l'ADN d'entrée grâce à l'acquisition du signal pour le tableau du génome de carrelage SMRT toute voie.
Protocol
Discussion
La mauvaise qualité de l'ADN ne fournira pas un profil d'hybridation bien. Il est essentiel de s'assurer que l'échantillon d'ADN de référence et sont exempts de contaminants tels que le phénol, l'ARN, le sel, etc qui peuvent interférer avec l'étape de marquage Premier aléatoire avant de commencer une expérience d'hybridation. Par exemple, la remise en suspension de l'ADN dans Tris – EDTA (TE) au lieu de l'eau n'est pas recommandée car la concentration en sel élevée peut inhiber la réa…
Acknowledgements
Nous tenons à remercier les membres de l'équipe de Wan Lam Lab tableau BAC particulier Miwa Suzuki et Bryan Chi pour la préparation de cet article. Ce travail a été soutenu par des fonds des Instituts canadiens de recherche en santé, Génome Canada / Génome Colombie-Britannique, et le NIH / NIDCR octroi RO1 DE15965-01.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 5X Klenow Buffer | Reagent | Promega | ||
| Random Octamers | Reagent | Alpha DNA | ||
| 10X dNTP mix | Reagent | Promega | 2mM dATP, dGTP, dTTP, 1.2mM dCTP | |
| Cy-3 labeled dCTP | Reagent | GE Healthcare | ||
| Cy-5 labeled dCTP | Reagent | GE Healthcare | ||
| Human Genomic DNA Reference | Reagent | Novagen | Example of a possible reference | |
| Klenow | Reagent | Promega | ||
| YM-30 Column | Reagent | Millipore | ||
| Cot-1 DNA | Reagent | Invitrogen | ||
| DIG Easy | Reagent | Roche | ||
| Sheared Herring Sperm DNA | Reagent | Promega | ||
| Coverslip | Reagent | Fisher Scientific | 22mm x 60mm | |
| Hybridization Cassette | Tool | Telechem |
References
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