全ゲノムアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーションの技術デモンストレーション
Summary
このビデオでは、アーカイブホルマリン固定材料など、さまざまなソースから単離することができるDNAの唯一の25から100 ngを用いてヒトゲノム全体をスキャンして全ゲノムタイリングのパスアレイCGH、のためのハイブリダイゼーションプロトコルの技術的なデモンストレーションです。
Abstract
アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（アレイCGH）はゲノム1のDNAセグメントまたは遺伝子量の損益を検出する方法です。この技術の最近の進歩により、がんやその他の遺伝性疾患2の遺伝子変異の同定のための全ゲノムの高解像度の比較を有効にしている。サブメガベース解像度タイルセットの配列（またはSMRT）の配列は、約100キロベースペア（KB）のセグメント2をヒトゲノムにまたがる約3万重複する細菌人工染色体（BAC）クローンのセットで構成されます。これらのBACの目標は、個々に合成し、単一のガラススライド2-4二重にスポットされています。アレイCGHは、競合ハイブリダイゼーションの原理に基づいています。サンプルとリファレンスのDNAは、差動シアニン- 3で標識し、シアニン- 5蛍光色素、及び配列に共同ハイブリダイズさせる。潜伏期間の後にバインドされていないサンプルは、スライドから洗浄され、配列が結像される。 SeeGH（www.flintbox.ca）と呼ばれる自由に利用できるカスタムソフトウェアパッケージは、収集した大量のデータを処理するために使用されます – 単一の実験では、53892のデータポイントを生成します。 SeeGHは垂直に染色体の位置を5,6に整列されている各BACのターゲットで2サンプル間のLOG2信号の強度比を可視化する。 SMRTの配列は、サイズ7の50キロバイトのような小さな変化を検出することができます。 SMRTの配列は、DNAの利益、損失、増幅およびホモ接合の欠失を含むDNA再構成のさまざまなイベントを検出することができます。 SMRTの配列のユニークな利点は1つが、ホルマリン固定パラフィン包埋サンプルから単離されたDNAを使用できることです。非増幅DNA（25 – 100ng）の低入力要件と組み合わせるとこのようなマイクロダイセクション7,8で生成されるものとして貴重なサンプルのプロファイリングが可能になります。これは、十分な標識サンプルの結合は検出のための信号を生成することができます各BACのハイブリダイゼーションのターゲットの大きなサイズに起因する。このプラットフォームのもう一つの利点は、退屈な組織マイクロダイセクション8の必要性を減少させる、組織の不均一性の許容範囲です。このビデオプロトコルは、全ゲノムのタイルのパスのSMRTの配列のために買収を通知することによって入力のDNAをラベリングからステップバイステップのチュートリアルです。
Protocol
Discussion
低品質のDNAは、適切なハイブリダイゼーションのプロファイルを提供することはありません。それはそのサンプルとリファレンスDNAを確保するために不可欠であるようなハイブリダイゼーション実験を開始する前に、ランダムプライムラベリングステップを妨げる可能性フェノール、RNA、塩、等のような汚染物質から自由である。例えば、トリスのDNAの再懸濁 – 水の代わりにEDTA（TE）は、高塩濃度として推?…
Acknowledgements
我々は、この記事の準備のために特にWANラムラボBACアレイのチームのメンバー三輪鈴木とブライアンホーチミンに感謝したい。この作品は、ヘルスリサーチ、ゲノムカナダ/ゲノムブリティッシュコロンビア州、およびNIH / NIDCR助成金RO1 DE15965 – 01のためのカナダの協会からの資金によって支えられている。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 5X Klenow Buffer | Reagent | Promega | ||
| Random Octamers | Reagent | Alpha DNA | ||
| 10X dNTP mix | Reagent | Promega | 2mM dATP, dGTP, dTTP, 1.2mM dCTP | |
| Cy-3 labeled dCTP | Reagent | GE Healthcare | ||
| Cy-5 labeled dCTP | Reagent | GE Healthcare | ||
| Human Genomic DNA Reference | Reagent | Novagen | Example of a possible reference | |
| Klenow | Reagent | Promega | ||
| YM-30 Column | Reagent | Millipore | ||
| Cot-1 DNA | Reagent | Invitrogen | ||
| DIG Easy | Reagent | Roche | ||
| Sheared Herring Sperm DNA | Reagent | Promega | ||
| Coverslip | Reagent | Fisher Scientific | 22mm x 60mm | |
| Hybridization Cassette | Tool | Telechem |
References
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