전체 게놈 배열 비교 게놈 하이브 리다이 제이션의 기술의 데모
Summary
이 비디오 아카이브 포르말린 고정 재료를 포함한 다양한 소스에서 격리 수있는 DNA의 단지 25-100 NG를 사용하여 전체 인간 게놈을 검사 전체 게놈 기와 경로 배열 CGH에 대한 하이브 리다이 제이션 프로토콜의 기술 데모입니다.
Abstract
배열 비교 게놈 하이브 리다이 제이션의 (배열 CGH)은 DNA의 세그먼트 또는 게놈 1 유전자 복용량의 이득과 손실을 검출하는 방법입니다. 이 기술의 최근 발전은 암 및 기타 유전 질환 2 유전자 변경의 식별을 위해 전체 genomes의 고해상도 비교를 활성화했습니다. 서브 Megabase 해상도 기와 집합 배열 (또는 SMRT) 배열은 약 삼만은 세균 인공 염색체 (BAC) ~ 100 kilobase 쌍에서 인간 게놈 (KB) 세그먼트 2 스팬 클론을 중복 집합으로 구성되어 있습니다. 이러한 BAC 대상 개별적으로 합성하여 하나의 유리 슬라이드에 중복 2-4에서 발견됩니다. 배열 CGH 경쟁 하이브 리다이 제이션의 원칙에 따라 달라집니다. 샘플 및 참조 DNA가 differentially Cyanine – 3으로 표시하고 Cyanine – 5 형광 염료 및 배열에 공동 hybridized입니다. 잠복기 후 언바운드 샘플은 슬라이드에서 씻은되며 배열이 몇 군데 있습니다. SeeGH (www.flintbox.ca)라는 무료로 사용 가능한 맞춤 소프트웨어 패키지는 수집된 데이터의 양이를 처리하는 데 사용됩니다 – 하나의 실험 53,892 데이터 포인트를 생성합니다. SeeGH 수직 염색체 위치를 5,6에 부합되는 각 BAC 대상에서 2 샘플 사이의 log2 신호 강도 비율을 시각화. SMRT 배열 크기 7 50킬로바이트만큼 작은 변경을 감지할 수 있습니다. SMRT의 배열은 DNA의 수익, 손실, amplifications 및 homozygous 삭제를 포함한 DNA를 다시 정리하기의 다양한 행사를 검색할 수 있습니다. SMRT 배열의 독특한 장점은 하나 포르말린 고정 파라핀 임베디드 샘플에서 DNA 격리를 사용할 수있다는 것입니다. unamplified DNA (25 – 100ng)의 낮은 입력 요구 사항과 결합하면이 같은 microdissection 7,8에 의해 만들어진 것과 같은 귀중한 샘플 프로파일 수 있습니다. 이것은 충분한 레이블 샘플의 바인딩이 검출을위한 신호를 생성하실 수 있습니다 각 BAC의 하이브리드화 대상의 대형에 따라 결정됩니다. 이 플랫폼의 또 다른 장점은 지루한 조직 microdissection 8의 필요성을 감소, 조직 이질의 오차이다. 이 비디오 프로토콜은 전체 게놈의 기와 경로 SMRT 배열에 대한 인수를 신호까지 입력 DNA를 라벨의 단계별 자습서입니다.
Protocol
Discussion
불쌍한 품질 DNA 좋은 하이브리드화 프로필을 제공하지 않습니다. 그것은 샘플을 보장하기 위해 필수적이며, 참조 DNA는 페놀, RNA, 소금, 하이브 리다이 제이션 실험을 시작하기 전에 임의의 주요 상표 단계에 방해가 될 수 등으로 오염 물질에서 무료입니다. 예를 들어 트리스에서 DNA의 resuspension – 대신 물 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (TE)가 높은 소금 농도로 사용하지 않는 것이 좋습니다는 상표 반응을 억?…
Acknowledgements
우리는이 문서의 준비 완 램 랩 BAC 배열 팀은 특히 미와 스즈키와 브라이언 치의 회원 감사하고 싶습니다. 이 작품은 건강 연구, 게놈 캐나다 / 게놈 브리티시 컬럼비아, 그리고 NIH / NIDCR 부여 RO1 DE15965 – 01에 대한 캐나다 연구소에서 자금을 지원했다.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 5X Klenow Buffer | Reagent | Promega | ||
| Random Octamers | Reagent | Alpha DNA | ||
| 10X dNTP mix | Reagent | Promega | 2mM dATP, dGTP, dTTP, 1.2mM dCTP | |
| Cy-3 labeled dCTP | Reagent | GE Healthcare | ||
| Cy-5 labeled dCTP | Reagent | GE Healthcare | ||
| Human Genomic DNA Reference | Reagent | Novagen | Example of a possible reference | |
| Klenow | Reagent | Promega | ||
| YM-30 Column | Reagent | Millipore | ||
| Cot-1 DNA | Reagent | Invitrogen | ||
| DIG Easy | Reagent | Roche | ||
| Sheared Herring Sperm DNA | Reagent | Promega | ||
| Coverslip | Reagent | Fisher Scientific | 22mm x 60mm | |
| Hybridization Cassette | Tool | Telechem |
References
- Lockwood, W. W., Chari, R., Chi, B., Lam, W. L. Recent advances in array comparative genomic hybridization technologies and their applications in human genetics. European Journal of Human Genetics. 14, 139-1x`48 (2006).
- Ishkanian, A. S., Malloff, C. A., Watson, S. K., deLeeuw, R. J., Chi, B., Coe, B. P., Snijders, A., Albertson, D. G., Pinkel, D., Marra, M. A., Ling, V., MacAulay, C., Lam, W. L. A tiling resolution DNA microarray with complete coverage of the human genome. Nature Genetics. 36, 299-303 (2004).
- Watson, S. K., DeLeeuw, R. J., Ishkanian, A. S., Malloff, C. A., Lam, W. L. Methods for high throughput validation of amplified fragment pools of BAC DNA for constructing high resolution CGH arrays. BMC Genomics. 5, 6 (2004).
- Watson, S. K., DeLeeuw, R. J., Horsman, D. E., Squire, J. A., Lam, W. L. Cytogenetically balanced translocations are associated with focal copy number alterations. Human Genetics. 120, 795-805 (2007).
- Chi, B., DeLeeuw, R. J., Coe, B. P., MacAulay, C., Lam, W. L. SeeGH — a software tool for visualization of whole genome array comparative genomic hybridization data. BMC Bioinformatics. 5, 13 (2004).
- Chi, B., DeLeeuw, R. J., Coe, B. P., Ng, R. T., MacAulay, C., Lam, W. L. MD-SeeGH: a platform for integrative analysis of multi-dimensional genomic data. BMC Bioinformatics. 9, 243 (2008).
- Coe, B. P., Ylstra, B., Carvalho, B., Meijer, G. A., Macaulay, C., Lam, W. L. Resolving the resolution of array CGH. Genomics. 89, 647-653 (2007).
- Garnis, C., Coe, B. P., Lam, S. L., MacAulay, C., Lam, W. L. High-resolution array CGH increases heterogeneity tolerance in the analysis of clinical samples. Genomics. 85, 790-793 (2005).
