Método para la Cultura de primeros embriones del polluelo ex vivo (Nueva Cultura)
Summary
Este video muestra la nueva cultura, un método por el cual los embriones de pollo se cultivan fuera del huevo hasta por 24 horas. Este método le permite a uno para estudiar el desarrollo temprano (línea primitiva a 14 som.), Un período que corresponde a E7-9 en el ratón. Las aplicaciones de esta técnica incluyen la electroporación, la hibridación in situ e inmunohistoquímica.
Abstract
El embrión de pollo es una herramienta valiosa en el estudio del desarrollo embrionario temprano. Su transparencia, accesibilidad y facilidad de manipulación, lo hacen una herramienta ideal para estudiar la formación y los patrones del cerebro, del tubo neural, somite y primordios corazón. Aplicaciones de la cultura de embrión de pollo incluyen electroporación de construcciones de ADN o ARN para analizar la función del gen, los injertos de cuentas del factor de crecimiento FGF revestidos, tales como BMP y, así como montar toda la hibridación in situ e inmunohistoquímica. Este video muestra los diferentes pasos en la cultura de embrión de pollo, En primer lugar, el embrión es explantados en solución salina. Luego, el embrión se centra en un anillo de cristal. Las membranas que rodean el embrión se levantan a lo largo de las paredes del anillo. El anillo se coloca en un plato de cultivo que contiene un grupo de albúmina. La placa de cultivo se sella y se coloca en una cámara húmeda, donde el embrión se cultiva durante hasta 24 horas. Finalmente, el embrión se retira del ring, fijados y procesados para otras aplicaciones. Una guía de solución de problemas también se presenta.
Protocol
Discussion
El método de cultivo de Nueva 2 puede ser utilizado para una amplia variedad de aplicaciones, que van desde los injertos de factor de crecimiento que contiene perlas de tres, para montar toda la hibridación in situ y todo monte inmunohistoquímica 4. La cultura durante un período de 24 horas permite el seguimiento continuo del desarrollo embrionario en aplicaciones tales como el análisis de lapso de tiempo el movimiento celular 5 o el seguimiento de las buenas prácticas agra…
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Margaret M. Alkek a RHF.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Eggs | Animal | Charles River Laboratories | Premium Fertile | |
| Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 or similar | |
| Marsh Automatic Incubator | Tool | Lyon | RX | |
| Hybridization Incubator | Tool | Robbins Scientific | M1000 | |
| Pyrex dish (2) | Tool | |||
| Watchmaker’s glass 50mm | Tool | VWR | 66112-060 | |
| Glass rings | Tool | Physical Plant facility | cut 4 mm thick sections of glass tubing (27 mm outer diam, 25 mm inner diam). Do not fine polish. | |
| Curved Forceps (1) | Surgery | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Forceps (2) | Surgery | Fine Science Tools | 11002-13 | blunt ended using sharpening Stone and 100ul mineral oil |
| Sharpening Stone Dan’s Black Arkansas | Surgery | Electron Microscopy Sciences | 62082-00 | |
| Fine scissors | Surgery | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Plastic dishes | Tool | Falcon | 353001 | |
| Rubber Bulb | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70980 | |
| Pasteur Capillary Pipette | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | round edge under flame |
| Microcapillary tube | Surgery | Sigma | P1049-1PAK | Pull using vertical micropipette puller; blunt end with fine forceps |
| Microdissecting knife | Surgery | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to puncture cavities prior to in situ hybridization |
| Minuten pins 0.2mm diam | Surgery | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Reagent | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
| Diethylpyrocarbonate (depc) | Reagent | Acros Organics | 10025025 | Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave |
References
- Pannett, P. A., Compton, C. A. The cultivation of tissues in saline. Lancet. 206, 381-384 (1924).
- New, D. T. A new technique for the cultivation of the chick embryo in vitro. J. Embryol. Exp. Morph. 3, 326-331 (1955).
- Alvarez, I. S., Araujo, M., Nieto, M. A. Neural induction in whole chick embryo cultures by FGF. Dev. Biol. 199, 42-54 (1998).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen’s node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Fates and migratory routes of primitive streak cells in the chick embryo. Development. 122, 1523-1534 (1996).
- Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nature Protoc. 3, 419-426 (2008).
