Summary

इन विट्रो में पृथक न्यूरॉन्स चालाकी के लिए लेजर चिमटी का उपयोग

Published: September 11, 2008
doi:

Summary

यह वीडियो सभ्य न्यूरॉन्स इन विट्रो में लेजर चिमटी का उपयोग कर के हेरफेर का वर्णन करता है.

Abstract

इस कागज और वीडियो में, हम लक्ष्यीकरण regenerating सेल प्रक्रियाओं के इन विट्रो में वयस्क रेटिना न्यूरॉन्स की वरीयताओं को अध्ययन के लिए हमारी प्रयोगशाला में इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल का वर्णन. रेटिना सेल संस्कृतियों की तैयारी के लिए प्रक्रिया विच्छेदन, पाचन और रेटिना के trituration, लेजर चिमटी के साथ उपयोग के लिए विशेष रूप से बने बर्तन पर अलग रेटिना की कोशिकाओं के चढ़ाना के साथ और अंत के साथ शुरू करते हैं. इन व्यंजनों को एक सेल चिपकने वाला आधा और एक सेल repellant आधा में विभाजित हैं. सेल चिपकने वाला पक्ष साल एक एंटीबॉडी, जो एक सब्सट्रेट पर जो हमारी कोशिकाओं को बढ़ने प्रदान की एक परत के साथ लेपित है. अन्य चिपकने वाला substrates अन्य प्रकार की कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. सेल repellant पक्ष पाली – हेमा की एक पतली परत के साथ लेपित है. पकवान की पाली – हेमा पक्ष पर मढ़वाया कोशिकाओं लेजर चिमटी के साथ फंस रहे हैं, पहुंचाया और फिर एक सेल करने के लिए आसन्न साल एक तरफ एक जोड़ी बनाने के लिए रखा. किसी भी आकार के सेल समूहों का गठन इस तकनीक के साथ संभव होना चाहिए. "लेजर चिमटी नियंत्रित micromanipulation" का मतलब है कि अन्वेषक जो कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए चुन सकते हैं, और कोशिकाओं के बीच वांछित दूरी मानकीकृत किया जा सकता है. क्योंकि लेजर बीम संस्कृति पकवान की पारदर्शी सतहों के माध्यम से चला जाता है, सेल चयन और नियुक्ति एक संलग्न, बाँझ वातावरण में किया जाता है. कक्ष समय चूक वीडियो द्वारा नजर रखी जा सकता है और किसी भी सेल जैविक तकनीक की आवश्यकता के साथ इस्तेमाल किया. इस तकनीक को सेल सेल बातचीत की जांच में मदद मिल सकती है.

Protocol

संस्कृति में अलग कक्षों को जोड़ तोड़ के लिए ऑप्टिकल चिमटी ऑप्टिकल चिमटी के फँसाने बलों प्रकाश की गति (; Ashkin एट अल, 1986 Ashkin, 1991) से उत्पन्न कर रहे हैं. हालांकि इन बलों को आसानी से जाल निलंबन में कोशिक?…

Discussion

लाइट गति है, और जब एक प्रकाश किरण के रूप में यह एक सेल के माध्यम से गुजरता है refracted है, एक बल गति की दिशा बदलने के लिए आवश्यक है. गति के संरक्षण के कानून की वजह से, विपरीत दिशा में एक शक्ति, बारी में, किसी कक्ष पर वापस प्?…

Acknowledgements

अनुसंधान NIH EY012031 अनुदान और EY0182175 और एफएम Kirby फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
25mm circle No.1 coverglass   VWR Scientific Inc., Westchester, PA 48380 080  
poly-2-hydroxyethylmethacrylate (poly-HEMA)   Sigma Chemical Co., St Louis, MO P-3932 Dissolve in 95% ethanol
Goat anti-mouse IgG antibody   Chemicon International, Temecula CA AP181 1mg in 1ml, dilute 10x for use
Sal-1 supernatant containing mouse anti-salamander antibody   generously provided by Dr. Peter MacLeish   Dr. Peter MacLeish, Morehouse School of Medicine, Atlanta, GA
3 mm bore 5ml pyrex disposable pipets   Corning Inc., Corning NY 7078A-5  
Cell culture dishes 35mm x 10mm   Corning inc., Corning NY 430165  
Sylgard 184 silicone elastomer kit   Dow Corning Corp., Midland MI    
Optical tweezers-microtool or laser tweezers   Cell Robotics Inc., Albuquerque NM    
1 W continuous wave diode laser of 980nm wavelength   Cell Robotics Inc., Albuquerque NM    
Axiovert 100 inverted light microscope   Carl Zeiss Inc., Thornwood, NY    
40x oil immersion plan neofluor objective lens   Carl Zeiss Inc., Thornwood, NY   Numerical aperture (N.A. 1.3)
Black and white CCD camera   Sony Corporation, Tokyo, Japan    
Computer and joystick with software   Cell Robotics Inc.   for controlling a motorized stage

References

  1. Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a Single-Beam Gradient Force Optical Trap for Dielectric Particles. Opt. Lett. 11, 288-290 (1986).
  2. Clarke, R. J., Hoegnason, K., Brimacombe, M., Townes-Anderson, E. Cone and rod cells have different target preferences in vitro as revealed by optical tweezers. Mol. Vision. 14, 706-720 (2008).
  3. Folkman, J., Moscona, A. Role of cell shape in growth control. Nature. 273, 345-349 (1978).
  4. Liu, Y., Cheng, D. K., Soneck, G. J., Berns, M. W., Chapman, C. F., Tromberg, B. J. Evidence of localized cell heating induced by infrared optical tweezers. Biophysical Journal. 68, 2137-2144 (1995).
  5. MacLeish, P. R., Barnstable, C. J., Townes-Anderson, E. Use of a monoclonal antibody as a substrate for mature neurons in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80, 7014-7018 (1983).
  6. MacLeish, P. R., Townes-Anderson, E. Growth and synapse formation among major classes of adult salamander retinal neurons in vitro. Neuron. 1, 751-760 (1988).
  7. Mandell, J. W., MacLeish, P. R. Townes-Anderson E. Process outgrowth and synaptic varicosity formation by adult photoreceptors in vitro. J. Neurosci. 13, 3533-3548 (1993).
  8. Nachman-Clewner, M., Townes-Anderson, E. Injury-induced remodelling and regeneration of the ribbon presynaptic terminal in vitro. J. Neurocytol. 25, 597-613 (1996).
  9. Townes-Anderson, E., St Jules, R. S., Sherry, D. M., Lichtenberger, J., Hassanain, M. Micromanipulation of retinal neurons by optical tweezers. Mol. Vis.. 4, (1998).
check_url/kr/911?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Clarke, R., Wang, J., Townes-Anderson, E. Using Laser Tweezers For Manipulating Isolated Neurons In Vitro. J. Vis. Exp. (19), e911, doi:10.3791/911 (2008).

View Video