L'hétérogénéité cellulaire du tissu cérébral constitue une limitation importante pour l'étude des marqueurs épigénétiques de la chromatine, car la plupart des essais n'ont pas la résolution seule cellule. Les neurones sont généralement mêlés à des cellules gliales et les autres cellules non-neuronales. Nous fournissons un protocole pour extraire et collecter des noyaux des neurones du cerveau humain.
Abstract
Les neurones dans le cerveau humain devient postmitotiques largement au cours du développement prénatal, et donc de maintenir leurs noyaux à travers la pleine durée de vie. Cependant, on sait peu de changements dans la chromatine neuronale et l'organisation nucléaire au cours du développement et de vieillissement, ou dans la maladie neuropsychiatrique chronique. Toutefois, à ce jour la plupart des dosages d'ADN de la chromatine et basée (autres que les poissons) la résolution de cellules manquent unique. À cette fin, l'hétérogénéité cellulaire du tissu cérébral constitue une limitation importante, parce que les sous-populations différentes de neurones normalement sont mêlés à différents types de cellules gliales et les autres cellules non-neuronales. Une solution possible serait de développer un type de cellule cultures spécifiques, mais la plupart des cellules du SNC, y compris les neurones, sont ex vivo durable, au mieux, pour seulement quelques semaines et ne serait donc fournir un modèle incomplet pour des mécanismes épigénétiques pourraient exploitation à travers la pleine durée de vie . Ici, nous fournissons un protocole pour extraire et purifier les noyaux de surgelés (jamais fixe) du cerveau post-mortem humain. La méthode consiste à l'extraction de noyaux dans un tampon de lyse hypotonique, suivie par ultracentrifugation et immunotagging avec des anti-NeuN anticorps. Étiqueté noyaux des neurones sont ensuite collectés séparément en utilisant la fluorescence-activated tri. Cette méthode devrait être applicable à n'importe quelle région du cerveau dans une large gamme d'espèces et propice aux études d'immunoprécipitation de chromatine avec des sites et la modification spécifique des anticorps anti-histones et la méthylation de l'ADN et autres tests.
Protocol
Extraction des noyaux Mettez 250 mg de tissus post-mortem du cerveau congelé dans 5 mL 1 Lysis Buffer dans un douncer et le placer sur la glace. Pour recevoir environ 5 millions de noyaux après la FACS tri, nous utilisons habituellement 1000 mg de tissu par exemple. Une fois le tissu a été décongelé, le tissu Dounce pendant 1 minute tout sur la glace. Prenez le tissu homogénéisé et le placer dans un tube de 15 ml ultracentrifugeuse clair. Placer le tube sur la glace. </l…
Discussion
Le protocole présenté ici devrait être particulièrement utile pour les études ont porté sur les modifications épigénétiques de la chromatine neuronale et, plus généralement, sur le phénotype moléculaire du noyau des neurones, au cours normal de la maladie neurologique ou psychiatrique en développement et le vieillissement, ou dans. La méthode est particulièrement avantageuse lorsque l'hétérogénéité cellulaire des tissus du cerveau, y compris d'éventuelles modifications dans le neurone-glie à la ration au cours…
Acknowledgements
Les auteurs apprécient les conseils et l'appui technique fourni par le Dr Richard Konz et personnel de l'établissement de base de cytométrie en flux à l'Université du Massachusetts Medical School. Les ressources de base soutenu par le diabète de recherche en endocrinologie Centre DK032520 Grant ont également été utilisés. Ce travail est soutenu par des subventions de l'Institut national de santé mentale (NIMH), le National Institute of Drug Abuse (NIDA) et l'Institut national de la santé infantile et du développement humain.
Materials
Reagents:
1. Lysis Buffer
0.32M
Sucrose
5.47 g
5 mM
CaCl2
250 µl
3 mM
Mg(Acetate)2
150 µl
0.1 mM
EDTA
10 µl
10mM
Tris-HCl, pH8
500 µl
1 mM
DTT
17 µl
0.1%
Triton X-100
50 µl
Adjust volume to 50 ml with Autoclaved water
2. Sucrose Solution
1.8 M
Sucrose
30.78 g
3 mM
Mg(Acetate)2
150 µl
1 mM
DTT
17 µl
10 mM
Tris-HCl, pH8
500 µl
Adjust volume to 50 ml with Autoclaved water
3. Dounce buffer
10 mM
Tris
0.242 g
4 mM
MgCl2
0.163 g
1 mM
CaCl2
0.03 g
Adjust pH to 7.5 and volume to 200 ml with Autoclaved water