ميثليته الحمض النووي مناعي
Summary
هذا الفيديو يدل على بروتوكول للمناعي ميثليته الحمض النووي (MeDIP). MeDIP هو الإجراء الذي يستخرج يومين انتقائي شظايا من الحمض النووي ميثليته من عينة الحمض النووي الجيني باستخدام الأجسام المضادة مع خصوصية لmethylcytosine – 5 (MC – 5 المضادة).
Abstract
تحديد أنماط الحامض النووي هو اجراء شائع في دراسة علم التخلق ، كما هو معروف مثيلة لها آثار كبيرة على التعبير الجيني ، وتشارك مع التطور الطبيعي فضلا عن الأمراض<sup> 1-4</sup>. وبالتالي ، فإن القدرة على التمييز بين الحمض النووي والحمض النووي ميثليته ميثليته غير ضروري لتوليد ملامح مثيلة لمثل هذه الدراسات. ميثليته الحمض النووي مناعي (MeDIP) هو أسلوب فعال لاستخراج الحمض النووي ميثليته من عينة من الفائدة<sup> 5-7</sup>. عينة من اقل من 200 نانوغرام من الحمض النووي كافية للجسم ، أو مناعي (IP) ، رد فعل. الحمض النووي هو sonicated إلى شظايا تتراوح في حجمها من 300-1000 سنة مضت ، وينقسم إلى immunoprecipitated (IP) والمدخلات (IN) أجزاء. الحمض النووي IP الحرارة في وقت لاحق التشويه والتحريف وحضنت ثم مع 5'mC المضادة ، مما يتيح للجسم مضاد لربط الحمض النووي ميثليته. بعد هذا ، تضاف حبات المغناطيسي يحتوي على الأجسام المضادة الثانوية مع تقارب للجسم الأولية ، والمحتضنة. وهذه الأضداد حبة مرتبطة ربط الأضداد وحيدة النسيلة المستخدمة في الخطوة الأولى. يتم فصل الحمض النووي ملزمة للمجمع الأضداد (DNA ميثليته) عن بقية الحمض النووي باستخدام المغناطيس لسحب المجمعات من الحل. ثم يتم تنفيذ العديد من يغسل به العازلة للملكية الفكرية لإزالة غير منضم ، وعدم ميثليته الحمض النووي. يتم هضمها ثم ميثليته الحمض النووي / الضد المجمعات مع بروتين كاف لهضم الأجسام المضادة ولم يتبق سوى ميثليته الحمض النووي سليما. يتم تنقيته بواسطة الحمض النووي المخصب الفينول : استخراج الكلوروفورم لإزالة هذه المسألة البروتين وعجل ثم ومعلق في المياه لاستخدامها لاحقا. ويمكن استخدام تقنيات PCR للتحقق من كفاءة MeDIP الداخلي من خلال تحليل منتجات الملكية الفكرية والتضخيم في الحمض النووي للمناطق معروفة لعدم ومعروفة تحتوي على تسلسل ميثليته. ويمكن بعد ذلك تنقية الحمض النووي ميثليته تستعمل لمكان محدد (PCR) أو على مستوى الجينوم (ميكروأري وتسلسلها) دراسات مثيلة ، ومفيد خصوصا عند تطبيقها بالتعاون مع أدوات البحث الأخرى مثل التنميط التعبير الجيني والتهجين مجموعة الجينوم المقارن ( CGH)<sup> 8</sup>. واجراء مزيد من التحقيقات في الحامض النووي يؤدي إلى اكتشاف الأهداف جينية جديدة ، والتي بدورها ، قد تكون مفيدة في تطوير أدوات جديدة للأبحاث علاجية أو تشخيصية لأمراض مثل السرطان والتي تتميز الحمض النووي ميثليته aberrantly<sup> 2 ، 4 ، 11/09</sup>.
Protocol
Discussion
هناك وعي متزايد لتلعب دورا هاما في مرض الحامض النووي ، وبالتالي فإن تطوير فحوصات لقياس هذا التعديل أصبحت ذات أهمية متزايدة 3 ، 12 ، 13. تقنية MeDIP أداة قابلة للفحص في كل الجينوم ، ومكان محدد مستوى 6 و 7. هذا الأسلوب يوفر عرض سريع لمستويات الحامض النووي باستخدام ك…
Acknowledgements
نود أن نشكر أعضاء براون ومختبرات لام لمشاركتهم في هذا الفيديو النقد والمقالة. وأيد هذا العمل من جانب صناديق من المعاهد الكندية لأبحاث الصحة ومؤسسة مايكل سميث للبحوث الصحية.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Biorupter sonicator | Tool | Diagenode | UCD-200 TM | |
| 1.7ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes | 기타 | Sorenson BioScience | 11510 | |
| ND 3300 Spectrophotometer | Tool | NanoDrop | ||
| Primary Antibody: Anti-5′-methylcytosine mouse mAb | Reagent | CalBiochem | 162 33 D3 | |
| Secondary Antibody: Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG | Reagent | Invitrogen | 112-01D | |
| Magnetic Tube Rack | Tool | Invitrogen | CS15000 | |
| Mini LabRoller | Tool | Labnet International | H5500 | |
| IP Buffer | 10 mM NaPO4 pH 7.0, 140 mM NaCl, 0.05% Triton X-100. Stored at room temperature | |||
| Digestion Buffer | 10 mM Tris pH8.0, 100 mM EDTA, 0.5% SDS, 50 mM NaCl |
References
- Beck, S., Rakyan, V. K. The methylome: approaches for global DNA methylation profiling. Trends Genet. 24, 231-237 (2008).
- Lu, Q., et al. Epigenetics, disease, and therapeutic interventions. Ageing research reviews. 5, 449-467 (2006).
- Zilberman, D., Henikoff, S. Genome-wide analysis of DNA methylation patterns. Development. 134, 3959-3965 (2007).
- Feinberg, A. P., Tycko, B. The history of cancer epigenetics. Nature reviews. 4, 143-153 (2004).
- Weber, M., et al. Distribution, silencing potential and evolutionary impact of promoter DNA methylation in the human genome. Nat Genet. 39, 457-466 (2007).
- Weber, M., et al. Chromosome-wide and promoter-specific analyses identify sites of differential DNA methylation in normal and transformed human cells. Nat Genet. 37, 853-862 (2005).
- Wilson, I. M., et al. Epigenomics: mapping the methylome. Cell Cycle. 5, 155-158 (2006).
- Gazin, C., Wajapeyee, N., Gobeil, S., Virbasius, C. M., Green, M. R. An elaborate pathway required for Ras-mediated epigenetic silencing. Nature. 449, 1073-1077 (2007).
- Karpinski, P., Sasiadek, M. M., Blin, N. Aberrant epigenetic patterns in the etiology of gastrointestinal cancers. Journal of applied. 49, 1-10 (2008).
- Maekawa, M., Watanabe, Y. Epigenetics: relations to disease and laboratory findings. Current medicinal chemistry. 14, 2642-2653 (2007).
- Vucic, E. A., Brown, C. J., Lam, W. L. Epigenetics of cancer progression. Pharmacogenomics. 9, 215-234 (2008).
- Egger, G., Liang, G., Aparicio, A., Jones, P. A. Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy. Nature. 429, 457-463 (2004).
- Jones, P. A., Baylin, S. B. The fundamental role of epigenetic events in cancer. Nat Rev Genet. 3, 415-428 (2002).
- Fraga, M. F., Esteller, M. DNA methylation: a profile of methods and applications. Biotechniques. 33, 632-649 (2002).
