Metylerat DNA Immunoprecipitation
Summary
Denna video visar protokollet för metylerade DNA immunoprecipitation (MeDIP). MeDIP är en två dagars förfarande som selektivt utdrag metylerade DNA-fragment från en genomisk DNA-prov med hjälp av antikroppar med specificitet för 5-methylcytosine (anti-5 MC).
Abstract
Identifieringen av mönstren DNA-metylering är ett vanligt förfarande i studiet av epigenetik, eftersom metylering är känt för att ha betydande effekter på genuttryck, och deltar med normal utveckling och sjukdomar<sup> 1-4</sup>. Således är förmågan att skilja mellan metylerade DNA och icke-metylerat DNA avgörande för att generera metylering profiler för sådana studier. Metylerade DNA immunoprecipitation (MeDIP) är en effektiv teknik för utvinning av metylerade DNA från ett urval av intresse<sup> 5-7</sup>. Ett urval av så lite som 200 ng DNA är tillräckligt för antikroppen, eller immunoprecipitation (IP), reaktion. DNA är sonicated i fragment varierar i storlek från 300-1000 BP, och är indelad i immunoprecipitated (IP) och ingång (IN) portioner. IP-DNA är värme därefter denatureras och sedan inkuberas med anti-5'mC, vilket gör att den monoklonala antikroppen att binda metylerat DNA. Efter detta är magnetiska kulor med en sekundär antikropp med affinitet för den primära antikroppen till, och inkuberas. Dessa pärla kopplade antikroppar binder den monoklonala antikroppen som används i första steget. DNA är bundet till antikropp komplex (metylerat DNA) är skild från resten av DNA med hjälp av en magnet för att dra komplex av lösningen. Flera tvättar med IP buffert skall sedan genomföras för att ta bort obundna, icke-metylerat DNA. Den metylerade DNA / antikropp komplex är sedan kokas med proteinas K att smälta antikropparna vilket innebär att endast den metylerade DNA intakt. Det berikade DNA renas genom fenol: kloroform utvinning för att ta bort proteinet ärendet och sedan kondenseras och suspenderade i vatten för senare användning. PCR-teknik kan användas för att validera effektivitet MeDIP förfarande genom att analysera PCR-produkter av IP och IN DNA för regioner känd brist och kända för att innehålla denaturerad sekvenser. Det renade metylerade DNA kan sedan användas för locus-specifika (PCR) eller genom hela (microarray och sekvensering) metylering studier, och är särskilt användbart när den används tillsammans med annan forskning verktyg som profilering av genuttryck och array jämförande genomet hybridisering ( CGH)<sup> 8</sup>. Ytterligare undersökningar av DNA-metylering kommer att leda till upptäckten av nya epigenetiska mål, som i sin tur kan användas för att utveckla nya terapeutiska och prognostiska forskning verktyg för sjukdomar som cancer som kännetecknas av avvikande metylerade DNA<sup> 2, 4, 9-11</sup>.
Protocol
Discussion
Det finns en växande medvetenhet om de betydande metylering roll DNA spelar i sjukdomen, är därför att utveckla testmetoder för att mäta denna modifiering blir allt viktigare 3, 12, 13. Den MeDIP tekniken är en mottaglig verktyg för screening på både hel-genomet och locus-specifik nivå 6, 7. Denna teknik ger en snabb bild av nivåer DNA-metylering med hjälp av begränsade mängder start DNA och gör det lätt att jämförelser mellan olika källor. Nedströms program som använder MeDIP…
Acknowledgements
Vi vill tacka medlemmarna i Brown och Lam labb för deras deltagande i kritisera denna video och artikel. Detta arbete stöddes av medel från den kanadensiska Institutes for Health Research och Michael Smith Stiftelsen för hälsoforskning.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Biorupter sonicator | Tool | Diagenode | UCD-200 TM | |
| 1.7ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes | 기타 | Sorenson BioScience | 11510 | |
| ND 3300 Spectrophotometer | Tool | NanoDrop | ||
| Primary Antibody: Anti-5′-methylcytosine mouse mAb | Reagent | CalBiochem | 162 33 D3 | |
| Secondary Antibody: Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG | Reagent | Invitrogen | 112-01D | |
| Magnetic Tube Rack | Tool | Invitrogen | CS15000 | |
| Mini LabRoller | Tool | Labnet International | H5500 | |
| IP Buffer | 10 mM NaPO4 pH 7.0, 140 mM NaCl, 0.05% Triton X-100. Stored at room temperature | |||
| Digestion Buffer | 10 mM Tris pH8.0, 100 mM EDTA, 0.5% SDS, 50 mM NaCl |
References
- Beck, S., Rakyan, V. K. The methylome: approaches for global DNA methylation profiling. Trends Genet. 24, 231-237 (2008).
- Lu, Q., et al. Epigenetics, disease, and therapeutic interventions. Ageing research reviews. 5, 449-467 (2006).
- Zilberman, D., Henikoff, S. Genome-wide analysis of DNA methylation patterns. Development. 134, 3959-3965 (2007).
- Feinberg, A. P., Tycko, B. The history of cancer epigenetics. Nature reviews. 4, 143-153 (2004).
- Weber, M., et al. Distribution, silencing potential and evolutionary impact of promoter DNA methylation in the human genome. Nat Genet. 39, 457-466 (2007).
- Weber, M., et al. Chromosome-wide and promoter-specific analyses identify sites of differential DNA methylation in normal and transformed human cells. Nat Genet. 37, 853-862 (2005).
- Wilson, I. M., et al. Epigenomics: mapping the methylome. Cell Cycle. 5, 155-158 (2006).
- Gazin, C., Wajapeyee, N., Gobeil, S., Virbasius, C. M., Green, M. R. An elaborate pathway required for Ras-mediated epigenetic silencing. Nature. 449, 1073-1077 (2007).
- Karpinski, P., Sasiadek, M. M., Blin, N. Aberrant epigenetic patterns in the etiology of gastrointestinal cancers. Journal of applied. 49, 1-10 (2008).
- Maekawa, M., Watanabe, Y. Epigenetics: relations to disease and laboratory findings. Current medicinal chemistry. 14, 2642-2653 (2007).
- Vucic, E. A., Brown, C. J., Lam, W. L. Epigenetics of cancer progression. Pharmacogenomics. 9, 215-234 (2008).
- Egger, G., Liang, G., Aparicio, A., Jones, P. A. Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy. Nature. 429, 457-463 (2004).
- Jones, P. A., Baylin, S. B. The fundamental role of epigenetic events in cancer. Nat Rev Genet. 3, 415-428 (2002).
- Fraga, M. F., Esteller, M. DNA methylation: a profile of methods and applications. Biotechniques. 33, 632-649 (2002).
