انتقائية وسمها بروتينات سطح الخلية باستخدام CyDye DIGE ملونات فلور الحد الأدنى
Summary
وقد تجلى هناك طريقة بسيطة ومحددة لوضع العلامات الفلورسنت وتعزيز اكتشاف بروتينات سطح الخلية دون خطوة التجزئة. وتم تحليل وفرة الفرق في البروتينات سطح الخلية باستخدام الكهربائي ثنائي الأبعاد (2 – D) وEttan التكنولوجيا DIGE ™.
Abstract
البروتينات السطحية هي المركزية لقدرة الخلايا على الاستجابة لبيئتها وتتفاعل مع الخلايا المجاورة. ومن المعروف أن تكون محرضات من الإشارات كلها تقريبا داخل الخلايا. وعلاوة على ذلك ، وأنها تلعب دورا هاما في التكيف مع البيئة والعلاج من تعاطي المخدرات ، وغالبا ما تشارك في التسبب بالمرض والباثولوجيا (1). البروتين البروتين التفاعلات الجوهرية لمسارات الإشارات ، وكسب مزيد من التبصر في هذه العمليات البيولوجية المعقدة ، وهناك حاجة إلى طرق حساسة وموثوق بها لدراسة بروتينات سطح الخلية. يستخدم ثنائي الأبعاد (2 – D) الكهربائي على نطاق واسع للكشف عن المؤشرات الحيوية وغيرها من الاهداف في عينات البروتين معقدة لدراسة التغيرات التفاضلية. بروتينات سطح الخلية ، ويرجع ذلك جزئيا إلى تدني وفرة (1 2 ٪ من البروتينات الخلوية) ، التي يصعب كشفها في هلام 2 – D دون تجزئة أو بعض الأنواع الأخرى من تخصيب اليورانيوم. كما انهم غالبا ما تظهر على استحياء في 2 مد المواد الهلامية نظرا لطبيعتها مسعور والوزن الجزيئي عالية (2). في هذه الدراسة ، فإننا نقدم لبروتوكول جديد للخلايا سليمة باستخدام الأصباغ CyDye DIGE فلور الحد الأدنى لوضع العلامات المحددة والكشف عن هذه المجموعة المهمة من البروتينات. أظهرت النتائج العلامات المحددة لعدد كبير من بروتينات سطح الخلية مع الحد الأدنى من العلامات البروتينات داخل الخلايا. هذا البروتوكول هو سريعة ، سهلة الاستعمال ، ويمكن استخدام كل ثلاثة CyDye DIGE الأصباغ فلور الأدنى (قبرصي 2 ، 3 و [سي] [سي] 5) لتسمية سطح الخلية البروتينات. هذه الميزات تسمح لمضاعفة استخدام 2 – D جل الفرق الإسفار الكهربائي (2 – D DIGE) مع التكنولوجيا DIGE Ettan وتحليل التغييرات باستخدام بروتين تعبير DeCyder 2 – D برمجيات التحليل التفاضلي. وأعقب مستوى سطح الخلية بروتينات المصل خلال تجويع الخلايا CHO لفترات مختلفة من الوقت (أنظر الجدول 1). تم الكشف عن تغيرات صغيرة في وفرة مع دقة عالية ، ويتم اعتماد النتائج وفقا لأساليب إحصائية محددة.
Protocol
Discussion
تركيز البروتين
ويظهر لمحة عامة عن سير العمل وضع العلامات اثنين في الشكل 1. منذ خلايا لا تزال على حالها عند المسمى وفقا للبروتوكول بروتين سطح الخلية الوسم ، يتعرض فقط سطح الخلية البروتينات إلى صبغ. في بروتوكول قياسي DIGE Ettan ، يتم lysed ا?…
Acknowledgements
نشكر الأستاذ Dontscho Kerjaschki ، مايرهوفر كورينا وكريجر سيجورد في معهد علم الأمراض السريرية في جامعة فيينا ، النمسا لتعاونهما.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| CyDye DIGE Kit, 2 nmol | Reagent | GE Healthcare | 28-9345-30 | |
| 2-D Quant Kit | Reagent | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
| IPG Buffer pH 3-11NL | Reagent | GE Heallthcare | 17-6004-40 | |
| Immobiline DryStrip pH 3-11NL, 24 cm | Reagent | GE Healthcare | 17-6003-77 | |
| IPGbox | Tool | GE Healthcare | 28-9334-65 | |
| IPGbox kit | Tool | GE Healthcare | 28-9334-92 | |
| DeStreak Rehydration solution | Reagent | GE Healthcare | 17-6003-19 | |
| Immobiline DryStrip Cover Fluid | Reagent | GE Healthcare | 17-1335-01 | |
| Ettan IPGphor 3 IEF Unit | Instrument | GE Healthcare | 11-0033-64 | |
| Ettan IPGphor Manifold | Instrument component | GE Healthcare | 80-6498-38 | |
| Ettan DALTtwelve Gel Caster | Tool | GE Healthcare | 80-6467-22 | |
| Ettan DALTtwelve Separation Unit and Power Supply/Control Unit | Instrument | GE Healthcare | 80-6466-46 | 230 V unit: 80-6466-27 |
| Typhoon 9410 Variable Mode Imager | Instrument | GE Healthcare | 63-0055-81 | |
| Ettan Spot Picker | Instrument | GE Healthcare | 18-1145-28 | |
| Ettan Digester | Instrument | GE Healthcare | 18-1142-68 | |
| Ettan Spotter | Instrument | GE Healthcare | 18-1142-67 | |
| Ettan MALDI-TOF | Instrument | GE Healthcare | 18-1142-33 | |
| DeCyder 2-D Differential Analysis Software | 기타 | GE Healthcare | 28-4012-01 | |
| ImageQuant Analysis Software | 기타 | GE Healthcare | 28-9236-62 | |
| Urea | Reagent | GE Healthcare | 17-1319-01 | |
| CHAPS | Reagent | GE Healthcare | 17-1314-01 | |
| PlusOne Dithiothreitol (DTT) | Reagent | GE Healthcare | 17-1318-01 | |
| Bromophenol Blue | Reagent | GE Healthcare | 17-1329-01 | |
| Tris | Reagent | GE Healthcare | 17-1321-01 | |
| Sodium Dodecylsulfate (SDS) | Reagent | GE Healthcare | 17-1313-01 | |
| PlusOne Glycerol 87% | Reagent | GE Healthcare | 17-1325-01 | |
| PlusOne ReadySol IEF 40% T, 3% C | Reagent | GE Healthcare | 17-1310-01 | |
| PlusOne TEMED | Reagent | GE Healthcare | 17-1312-01 | |
| PlusOne Ammonium Persulfate | Reagent | GE Healthcare | 17-1311-01 | |
| PlusOne Glycine | Reagent | GE Healthcare | 17-1323-01 | |
| 2-D Sample Prep for membrane proteins | Reagent | Pierce | 89864 | |
| Streptomycin sulphate | Reagent | Invitrogen | 15140-122 |
References
- Jang, J. H., Hanash, S. M. Profiling of the cell surface proteome. Proteomics. 3, 1947-1954 (2003).
- Shin, B. K. Global profiling of the cell surface proteome of cancer cells uncovers an abundance of proteins with chaperone function. J Biol Chem. 9, 7607-7616 (2003).
- . Ettan DIGE System User Manual. GE Healthcare user manual 18-1164-40. , (2006).
- . DeCyder 2-D Differential Analysis Software v 6.0. GE Healthcare data file 11-0011-98 Edition AA. , (2004).
- . 2-D Electrophoresis using immobilized pH gradients, principles and methods. GE Healthcare handbook 80-6429-60 Edition AB. , (2002).
- . CyDye DIGE fluors and labeling kits. GE Healthcare data file 18-1164-84 Edition AB. , (2003).
- Mayrhofer, C., Krieger, S., Allmaier, G., Kerjaschki, D. DIGE compatible labeling of surface proteins on vital cells in vitro and in vivo. Proteomics. 2, 579-5785 (2006).
- . Selective labeling of cell-surface proteins using CyDye DIGE Fluor minimal dyes. GE Healthcare Application Note 11-0033-92 Edition AB. , (2005).
