Eine einfache und spezifische Methode wurde für Fluoreszenzmarkierung und verbesserte Erkennung von Zelloberflächen-Proteine ohne Fraktionierung Schritt demonstriert. Differential Fülle in Zelloberflächenproteine wurde mittels zweidimensionaler (2-D)-Elektrophorese und Ettan ™ DIGE Technologie.
Oberflächen-Proteine sind von zentraler Bedeutung für die Fähigkeit der Zelle auf ihre Umwelt reagieren und mit den benachbarten Zellen zu interagieren. Sie sind dafür bekannt, Induktoren von fast allen intrazelluläre Signalwege werden. Darüber hinaus spielen sie eine wichtige Rolle im Umweltschutz Anpassung und medikamentöse Behandlung, und sind oft in der Krankheitsentstehung und die Pathologie (1) beteiligt. Protein-Protein-Wechselwirkungen sind untrennbar mit Signalwegen, und einen tieferen Einblick in diese komplexe biologische Prozesse zu gewinnen, sind empfindlicher und zuverlässiger Methoden zur Untersuchung von Zelloberflächen-Proteine benötigt werden. Zweidimensionale (2-D)-Elektrophorese wird weitgehend für den Nachweis von Biomarkern und anderen Zielen in komplexen Protein-Proben, um differentielle Änderungen Studie verwendet. Zelloberflächenproteine, teils wegen ihrer geringen Menge (1 2% der zellulären Proteine) sind schwierig, in einem 2-D Gel ohne Fraktionierung oder eine andere Art der Bereicherung zu erkennen. Sie sind auch oft schlecht in 2-D Gelen aufgrund ihrer hydrophoben Natur und mit hohem Molekulargewicht (2) vertreten. In dieser Studie präsentieren wir ein neues Protokoll für intakte Zellen mit CyDye DIGE Fluor minimal Farbstoffe zur spezifischen Markierung und Erkennung von dieser wichtigen Gruppe von Proteinen. Die Ergebnisse zeigten, spezifische Markierung von einer großen Anzahl von Zelloberflächen-Proteine mit minimalen Kennzeichnung von intrazellulären Proteinen. Dieses Protokoll ist eine schnelle, einfach zu bedienen, und alle drei CyDye DIGE Fluor minimal Farbstoffen (Cy 2, Cy 3 und Cy 5) kann verwendet werden, um Zelloberflächen-Proteine zu markieren. Diese Funktionen ermöglichen zum Multiplexen mit der 2-D-Fluoreszenz Difference Gel-Elektrophorese (2-D DIGE) mit Ettan DIGE Technologie und Analyse der Proteinexpression Änderungen mit DeCyder 2-D Differential Analysis Software. Die Höhe der Zelloberfläche Proteine wurde während Serumentzug von CHO-Zellen für verschiedene Zeitspannen (siehe Tabelle 1). Kleine Veränderungen in Hülle und Fülle wurden mit hoher Genauigkeit erfasst und die Ergebnisse sind definiert durch statistische Methoden unterstützt.
Protein-Konzentration
Eine Übersicht über die beiden Kennzeichnung Workflows ist in Abbildung 1 dargestellt. Da die Zellen noch intakt sind, wenn sie gemäß der Zelloberfläche Proteinmarkierung Protokoll bezeichnet, werden nur die Zelloberflächenproteine, um den Farbstoff ausgesetzt. In der Standard-Ettan DIGE-Protokoll werden die Zellen lysiert vor der Etikettierung und Proteinen sowohl innerhalb als auch außerhalb der Zelle gekennzeichnet sind (Abb. 1). Die relative Menge des Farbstoff…
Wir danken Professor Dontscho Kerjaschki, Corina Mayrhofer und Sigurd Krieger am Institut für Klinische Pathologie, Universität Wien, Österreich für ihre Mitarbeit.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
CyDye DIGE Kit, 2 nmol | Reagent | GE Healthcare | 28-9345-30 | |
2-D Quant Kit | Reagent | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
IPG Buffer pH 3-11NL | Reagent | GE Heallthcare | 17-6004-40 | |
Immobiline DryStrip pH 3-11NL, 24 cm | Reagent | GE Healthcare | 17-6003-77 | |
IPGbox | Tool | GE Healthcare | 28-9334-65 | |
IPGbox kit | Tool | GE Healthcare | 28-9334-92 | |
DeStreak Rehydration solution | Reagent | GE Healthcare | 17-6003-19 | |
Immobiline DryStrip Cover Fluid | Reagent | GE Healthcare | 17-1335-01 | |
Ettan IPGphor 3 IEF Unit | Instrument | GE Healthcare | 11-0033-64 | |
Ettan IPGphor Manifold | Instrument component | GE Healthcare | 80-6498-38 | |
Ettan DALTtwelve Gel Caster | Tool | GE Healthcare | 80-6467-22 | |
Ettan DALTtwelve Separation Unit and Power Supply/Control Unit | Instrument | GE Healthcare | 80-6466-46 | 230 V unit: 80-6466-27 |
Typhoon 9410 Variable Mode Imager | Instrument | GE Healthcare | 63-0055-81 | |
Ettan Spot Picker | Instrument | GE Healthcare | 18-1145-28 | |
Ettan Digester | Instrument | GE Healthcare | 18-1142-68 | |
Ettan Spotter | Instrument | GE Healthcare | 18-1142-67 | |
Ettan MALDI-TOF | Instrument | GE Healthcare | 18-1142-33 | |
DeCyder 2-D Differential Analysis Software | 기타 | GE Healthcare | 28-4012-01 | |
ImageQuant Analysis Software | 기타 | GE Healthcare | 28-9236-62 | |
Urea | Reagent | GE Healthcare | 17-1319-01 | |
CHAPS | Reagent | GE Healthcare | 17-1314-01 | |
PlusOne Dithiothreitol (DTT) | Reagent | GE Healthcare | 17-1318-01 | |
Bromophenol Blue | Reagent | GE Healthcare | 17-1329-01 | |
Tris | Reagent | GE Healthcare | 17-1321-01 | |
Sodium Dodecylsulfate (SDS) | Reagent | GE Healthcare | 17-1313-01 | |
PlusOne Glycerol 87% | Reagent | GE Healthcare | 17-1325-01 | |
PlusOne ReadySol IEF 40% T, 3% C | Reagent | GE Healthcare | 17-1310-01 | |
PlusOne TEMED | Reagent | GE Healthcare | 17-1312-01 | |
PlusOne Ammonium Persulfate | Reagent | GE Healthcare | 17-1311-01 | |
PlusOne Glycine | Reagent | GE Healthcare | 17-1323-01 | |
2-D Sample Prep for membrane proteins | Reagent | Pierce | 89864 | |
Streptomycin sulphate | Reagent | Invitrogen | 15140-122 |