CyDye DIGEフルーア最小限の色素を用いた細胞表面タンパク質の選択的ラベリング
Summary
シンプルで具体的な方法は、分別工程なしで蛍光標識し、細胞表面タンパク質の拡張検出用に実証された。細胞表面タンパク質の差の存在量は、（2 – D）二次元電気泳動とEttan™DIGE技術を用いて解析した。
Abstract
表面タンパク質は、その環境に反応すると、隣接細胞と相互作用する細胞の能力の中心となっています。彼らはほとんどすべての細胞内シグナル伝達の誘導剤であることが知られている。また、彼らは環境適応や薬物治療で重要な役割を果たしており、しばしば疾患の病因と病理学（1）に関与している。タンパク質 – タンパク質相互作用は、シグナル伝達経路に固有であり、これらの複雑な生物学的プロセスのより多くの洞察を得るために、高感度かつ信頼性の高い方法は、細胞表面のタンパク質を研究するために必要とされる。二次元（2 – D）電気泳動は、差動の変化を研究するために複雑なタンパク質サンプルのバイオマーカーや他の標的の検出のために広範に使用されます。彼らの低濃度（細胞タンパク質の1 2％）が部分的に原因の細胞表面タンパク質は、分画もしくは濃縮のいくつかの他のタイプなしで2 – Dゲルで検出するのは困難である。彼らはまた、しばしば不十分な彼らの疎水性の性質と高分子量（2）による2 – Dゲルで表されます。本研究では、我々はタンパク質のこの重要なグループの特定のラベリングと検出のためのCyDye DIGEフルーア最小限の染料を使用して完全な細胞のための新しいプロトコルを提示する。結果は、細胞内タンパク質の最小限のラベルを持つ細胞表面タンパク質の大量の特定のラベルを示した。このプロトコルは、使用するために、迅速に簡単です、そしてすべての3つのCyDye DIGEフルーア最小限の色素（CY 2、サイ3、Cyの5）の細胞表面タンパク質を標識するために使用することができます。これらの機能は、DeCyder 2次元差分解析ソフトウェアを用いてタンパク質発現の変化のEttan DIGE技術と解析との2次元蛍光差ゲル電気泳動（2 – D DIGE）を用いて多重化することができます。細胞表面タンパク質のレベルは、時間の種々の長さのためのCHO細胞（表1参照）の血清飢餓の間に続いた。存在量の小さな変化を高精度に検出され、その結果は定義されている統計的手法によってサポートされています。
Protocol
Discussion
タンパク質濃度
twoラベリングワークフローの概要を図1に示されています。細胞表面タンパク質標識プロトコールに従ってラベル際に細胞がまだそのままなので、唯一の細胞表面タンパク質は、染料にさらされている。細胞内部だけでなく外部の標識とタンパク質が（図1）ラベルが付いている前に、標準的なEttan DIGEプロトコールでは、細胞を溶解している。細胞表面タン?…
Acknowledgements
我々は、彼らのコラボレーションのための臨床病理学、ウィーン、オーストリアの大学の研究所で教授Dontscho Kerjaschki、コリーナマイルホーファーとシグルドリーガーに感謝。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| CyDye DIGE Kit, 2 nmol | Reagent | GE Healthcare | 28-9345-30 | |
| 2-D Quant Kit | Reagent | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
| IPG Buffer pH 3-11NL | Reagent | GE Heallthcare | 17-6004-40 | |
| Immobiline DryStrip pH 3-11NL, 24 cm | Reagent | GE Healthcare | 17-6003-77 | |
| IPGbox | Tool | GE Healthcare | 28-9334-65 | |
| IPGbox kit | Tool | GE Healthcare | 28-9334-92 | |
| DeStreak Rehydration solution | Reagent | GE Healthcare | 17-6003-19 | |
| Immobiline DryStrip Cover Fluid | Reagent | GE Healthcare | 17-1335-01 | |
| Ettan IPGphor 3 IEF Unit | Instrument | GE Healthcare | 11-0033-64 | |
| Ettan IPGphor Manifold | Instrument component | GE Healthcare | 80-6498-38 | |
| Ettan DALTtwelve Gel Caster | Tool | GE Healthcare | 80-6467-22 | |
| Ettan DALTtwelve Separation Unit and Power Supply/Control Unit | Instrument | GE Healthcare | 80-6466-46 | 230 V unit: 80-6466-27 |
| Typhoon 9410 Variable Mode Imager | Instrument | GE Healthcare | 63-0055-81 | |
| Ettan Spot Picker | Instrument | GE Healthcare | 18-1145-28 | |
| Ettan Digester | Instrument | GE Healthcare | 18-1142-68 | |
| Ettan Spotter | Instrument | GE Healthcare | 18-1142-67 | |
| Ettan MALDI-TOF | Instrument | GE Healthcare | 18-1142-33 | |
| DeCyder 2-D Differential Analysis Software | 기타 | GE Healthcare | 28-4012-01 | |
| ImageQuant Analysis Software | 기타 | GE Healthcare | 28-9236-62 | |
| Urea | Reagent | GE Healthcare | 17-1319-01 | |
| CHAPS | Reagent | GE Healthcare | 17-1314-01 | |
| PlusOne Dithiothreitol (DTT) | Reagent | GE Healthcare | 17-1318-01 | |
| Bromophenol Blue | Reagent | GE Healthcare | 17-1329-01 | |
| Tris | Reagent | GE Healthcare | 17-1321-01 | |
| Sodium Dodecylsulfate (SDS) | Reagent | GE Healthcare | 17-1313-01 | |
| PlusOne Glycerol 87% | Reagent | GE Healthcare | 17-1325-01 | |
| PlusOne ReadySol IEF 40% T, 3% C | Reagent | GE Healthcare | 17-1310-01 | |
| PlusOne TEMED | Reagent | GE Healthcare | 17-1312-01 | |
| PlusOne Ammonium Persulfate | Reagent | GE Healthcare | 17-1311-01 | |
| PlusOne Glycine | Reagent | GE Healthcare | 17-1323-01 | |
| 2-D Sample Prep for membrane proteins | Reagent | Pierce | 89864 | |
| Streptomycin sulphate | Reagent | Invitrogen | 15140-122 |
References
- Jang, J. H., Hanash, S. M. Profiling of the cell surface proteome. Proteomics. 3, 1947-1954 (2003).
- Shin, B. K. Global profiling of the cell surface proteome of cancer cells uncovers an abundance of proteins with chaperone function. J Biol Chem. 9, 7607-7616 (2003).
- . Ettan DIGE System User Manual. GE Healthcare user manual 18-1164-40. , (2006).
- . DeCyder 2-D Differential Analysis Software v 6.0. GE Healthcare data file 11-0011-98 Edition AA. , (2004).
- . 2-D Electrophoresis using immobilized pH gradients, principles and methods. GE Healthcare handbook 80-6429-60 Edition AB. , (2002).
- . CyDye DIGE fluors and labeling kits. GE Healthcare data file 18-1164-84 Edition AB. , (2003).
- Mayrhofer, C., Krieger, S., Allmaier, G., Kerjaschki, D. DIGE compatible labeling of surface proteins on vital cells in vitro and in vivo. Proteomics. 2, 579-5785 (2006).
- . Selective labeling of cell-surface proteins using CyDye DIGE Fluor minimal dyes. GE Healthcare Application Note 11-0033-92 Edition AB. , (2005).
