Hücre yüzey Proteinlerin CyDye Dige Fluor Minimal Boyalar kullanarak Seçici Etiketleme
Summary
Basit ve spesifik bir yöntem, bir fraksiyonasyonu adım olmadan floresan etiketleme ve hücre yüzey proteinleri gelişmiş algılama gösterilmiştir. Hücre yüzey proteinleri Diferansiyel bereket, iki-boyutlu (2-D) elektroforez ve Ettan ™ Dige teknolojisi kullanılarak analiz edildi.
Abstract
Yüzey proteinleri hücre yeteneğini çevresine tepki ve komşu hücrelerle etkileşim merkezi. Onlar hemen hemen tüm hücre içi sinyal indükleyicileri olduğu bilinmektedir. Ayrıca, çevreye uyum ve ilaç tedavisi önemli bir rol oynar ve genellikle hastalık patogenezi ve patolojisi (1) katılan. Protein-protein etkileşimleri sinyal yolları içsel, ve bu karmaşık biyolojik süreçleri hakkında daha fazla bilgi elde etmek için, duyarlı ve güvenilir yöntemler, hücre yüzey proteinleri çalışmak için ihtiyaç vardır. İki boyutlu (2-D) elektroforez diferansiyel değişiklikleri incelemek için, karmaşık protein örneklerinin biyobelirteçleri ve diğer hedeflere tespiti için yaygın olarak kullanılır. Düşük bolluk (hücresel proteinlerin 1% 2) kısmen Hücre yüzey proteinleri, fraksiyonasyon ya da diğer tip zenginleştirme olmadan 2-D jel tespit etmek zordur. Onlar da sık sık kötü hidrofobik doğa ve yüksek molekül ağırlıklı (2) nedeniyle 2-B jeller temsil edilmektedir. Bu çalışmada, özel etiketleme ve proteinlerin bu önemli grup tespiti için CyDye Dige Fluor minimal boyalar kullanarak sağlam hücreler için yeni bir protokol mevcut. Hücre yüzey proteinleri hücre içi proteinler en az etiketleme ile çok sayıda özel etiketleme gösterdi. Bu protokol, hızlı, basit, kullanımı ve her üç CyDye Dige Fluor minimal boyalar (2, Cy Cy 3 ve Cy 5), hücre yüzey proteinleri etiket için kullanılabilir. Bu özellikler DeCyder 2-D Diferansiyel Analiz Yazılımı kullanarak protein ekspresyonu değişiklikleri Ettan Dige teknolojisi ve analizi ile 2-B Floresan Fark Jel Elektroforez (2-D Dige) kullanarak çoklama için izin verir. Hücre yüzey proteinleri zaman çeşitli uzunluklarda CHO hücreler (bkz. Tablo 1) serum açlık sırasında izledi. Yüksek doğruluk ile bolluk içinde küçük değişiklikler tespit edildi ve sonuçları tanımlanan istatistiksel yöntemler ile desteklenmektedir.
Protocol
Discussion
Protein konsantrasyonu
Iki etiketleme iş akışlarının bir bakış Şekil 1'de gösterilmiştir. Hücre yüzey proteini etiketleme protokole göre etiketli hücreleri hala bozulmamış olduğundan, sadece hücre yüzey proteinleri boya maruz kalmaktadır. , Etiketleme ve proteinlerin hücre içinde yanı sıra dış (Şekil 1) etiketli önce standart Ettan Dige protokolde, hücreler parçalanmış. Hücre yüzey proteinleri özellikle quantitated olamaz bu yana boya hücre yüzey protei…
Acknowledgements
Biz onların işbirliği için, Viyana, Avusturya Üniversitesi Klinik Patoloji Enstitüsü Profesör Dontscho Kerjaschki, Corina Mayrhofer ve Sigurd Krieger teşekkür ederim.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| CyDye DIGE Kit, 2 nmol | Reagent | GE Healthcare | 28-9345-30 | |
| 2-D Quant Kit | Reagent | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
| IPG Buffer pH 3-11NL | Reagent | GE Heallthcare | 17-6004-40 | |
| Immobiline DryStrip pH 3-11NL, 24 cm | Reagent | GE Healthcare | 17-6003-77 | |
| IPGbox | Tool | GE Healthcare | 28-9334-65 | |
| IPGbox kit | Tool | GE Healthcare | 28-9334-92 | |
| DeStreak Rehydration solution | Reagent | GE Healthcare | 17-6003-19 | |
| Immobiline DryStrip Cover Fluid | Reagent | GE Healthcare | 17-1335-01 | |
| Ettan IPGphor 3 IEF Unit | Instrument | GE Healthcare | 11-0033-64 | |
| Ettan IPGphor Manifold | Instrument component | GE Healthcare | 80-6498-38 | |
| Ettan DALTtwelve Gel Caster | Tool | GE Healthcare | 80-6467-22 | |
| Ettan DALTtwelve Separation Unit and Power Supply/Control Unit | Instrument | GE Healthcare | 80-6466-46 | 230 V unit: 80-6466-27 |
| Typhoon 9410 Variable Mode Imager | Instrument | GE Healthcare | 63-0055-81 | |
| Ettan Spot Picker | Instrument | GE Healthcare | 18-1145-28 | |
| Ettan Digester | Instrument | GE Healthcare | 18-1142-68 | |
| Ettan Spotter | Instrument | GE Healthcare | 18-1142-67 | |
| Ettan MALDI-TOF | Instrument | GE Healthcare | 18-1142-33 | |
| DeCyder 2-D Differential Analysis Software | 기타 | GE Healthcare | 28-4012-01 | |
| ImageQuant Analysis Software | 기타 | GE Healthcare | 28-9236-62 | |
| Urea | Reagent | GE Healthcare | 17-1319-01 | |
| CHAPS | Reagent | GE Healthcare | 17-1314-01 | |
| PlusOne Dithiothreitol (DTT) | Reagent | GE Healthcare | 17-1318-01 | |
| Bromophenol Blue | Reagent | GE Healthcare | 17-1329-01 | |
| Tris | Reagent | GE Healthcare | 17-1321-01 | |
| Sodium Dodecylsulfate (SDS) | Reagent | GE Healthcare | 17-1313-01 | |
| PlusOne Glycerol 87% | Reagent | GE Healthcare | 17-1325-01 | |
| PlusOne ReadySol IEF 40% T, 3% C | Reagent | GE Healthcare | 17-1310-01 | |
| PlusOne TEMED | Reagent | GE Healthcare | 17-1312-01 | |
| PlusOne Ammonium Persulfate | Reagent | GE Healthcare | 17-1311-01 | |
| PlusOne Glycine | Reagent | GE Healthcare | 17-1323-01 | |
| 2-D Sample Prep for membrane proteins | Reagent | Pierce | 89864 | |
| Streptomycin sulphate | Reagent | Invitrogen | 15140-122 |
References
- Jang, J. H., Hanash, S. M. Profiling of the cell surface proteome. Proteomics. 3, 1947-1954 (2003).
- Shin, B. K. Global profiling of the cell surface proteome of cancer cells uncovers an abundance of proteins with chaperone function. J Biol Chem. 9, 7607-7616 (2003).
- . Ettan DIGE System User Manual. GE Healthcare user manual 18-1164-40. , (2006).
- . DeCyder 2-D Differential Analysis Software v 6.0. GE Healthcare data file 11-0011-98 Edition AA. , (2004).
- . 2-D Electrophoresis using immobilized pH gradients, principles and methods. GE Healthcare handbook 80-6429-60 Edition AB. , (2002).
- . CyDye DIGE fluors and labeling kits. GE Healthcare data file 18-1164-84 Edition AB. , (2003).
- Mayrhofer, C., Krieger, S., Allmaier, G., Kerjaschki, D. DIGE compatible labeling of surface proteins on vital cells in vitro and in vivo. Proteomics. 2, 579-5785 (2006).
- . Selective labeling of cell-surface proteins using CyDye DIGE Fluor minimal dyes. GE Healthcare Application Note 11-0033-92 Edition AB. , (2005).
