Summary
쥐 후각 시스템의 기본, 아직 고유의 특성은 생물학 자 사이의 증가 공부를 주도했습니다. 그 함수의 비교적 간단 평가 그때도 필요합니다. 여기 마우스 후각 감성과 선호도의 특성에 대한 민감한 테스트를 설명합니다.
Abstract
쥐 후각 시스템 때문에 틀에 박힌, 아직 접근이 회로의 시스템 생물학, 부분, 연구 과학자, 이익을 증가입니다. 또한, 유기체의 일생 동안 새로운 뉴런을 생성하기 위해이 지역의 독특한 능력은 모두 발달 및 재생 생물학을위한 매력적인 시스템이 있습니다. 이러한 관심은 후각 기능의 빠르고, 아직 신뢰성 평가를위한 수단을 필요로. 후각 능력의 많은 시험은 특별히 쥐를위한 복잡한 변수 또는하지 않습니다. 또한, 일부 테스트는 메모리 결손뿐만 아니라 후각 능력, 혼란함을 주죠 얻은 결과에 결함 민감합니다.
여기, 우리는 후각 감성과 선호도에 결함을 식별하기위한 테스트의 간단한 배터리를 설명합니다. 첫째, 초기 일반적인 건강 평가 추가 테스트에 적합한 동물의 식별을 허용합니다. 둘째, 생쥐가 임계값 차이가 있는지 확인할 냄새 다양한 dilutions에 노출되어 있습니다. 셋째, 생쥐는 후각 선호의 평가를 허용 매력적이고 aversive 모두 각종 냄새, 함께 제공됩니다. 이 간단한 연구는 다양한 자원과 전문 지식의 실험실에 대한 접근 후각 행동의 초기 특성을 만들어야합니다.
Protocol
일반 건강 시험
일반 건강 시험보다 포괄적인 치료가 재클린 크롤리의 훌륭한 행동 phenotyping 리소스에서 찾을 수 있습니다, 어떻게 내 마우스 잘못 된거 아냐? 1. 우리는 먼저 대상의 일반적인 건강을 평가하기 위해 수정된 관측 테스트 배터리를 사용합니다. 배터리는 신속하게 추가 테스트를 위해 적합합니다 그 과목을 식별하는 사무엘 어윈의 포괄적인 평가 절차 2 항목을 포함합니다. 간단히 수정 배터리가 물리적으로 비정상 아르 동물을 식별합니다 (예 : 심한 이하 또는 비만인 제대로 손질, dyspneic) 또는 전시 비정상적인 자세, 운동 또는 행동. 이 모든 질병의 발현 수 있습니다. 마찬가지로 건강하지 못한 과목을 식별하는 초기 평가 적합합니다.
동물 일반 건강 검사하는 동안뿐만 아니라 차후 테스트를하는 동안 편안하게 모두 사용됩니다 또한 중요하다. 이 검사는 어떤 잠재적으로 고통스런 절차를 포함하지 않는 아무 마취 또는 진통제를 사용하지 않습니다.
후각 민감도 테스트
이 테스트는 쥐를 두 그룹 (예 : 야생 동물의 종류와 돌연변 그룹) 사이의 후각 감성의 차이를 감지하도록 설계되었습니다. 이 테스트에서는 향기의 여러 dilutions가 만들어집니다. 나이브 동물 그러면 기록이 향기와 총 탐험 시간 (3 분 이내)의 단일 희석을 조사. 향기 여러 dilutions는 다른, 순진한 주제에 대한 테스트 및 총 탐험 시간이 생쥐의 각 그룹에 대해 선량 반응 곡선을 생성하는 데 사용됩니다. 두 연구자는 주제 genotypes 및 / 또는 조건 한 맹인과 테스트에 참여해야합니다.
기본 연구
- 네 깨끗한 새장 (인치 8 H × 10 W X 18 L), 침구 않고를 구합니다. biosafety 캐비닛에있는 네 개의 버팀대 줄을.
- 불투명 필터 용지를 사용하여 각 분야 사이의 파티션을 설정합니다. 마지막 파티션에 걸쳐 검은 포스터 보드를 배치 등 그 검은 측면 라인 케이지의 측면과 하단. 빛이 무대 조명 수 있도록 플렉시 글라스의 명확한 조각과 함께 경기장 상단의 커버.
(A)
(B) 
그림 1. 경기장 셋업. (A) 적절히 draped, 빈 경기장 (B) 아레나 제목과 향수 필터 종이. - 과목 habituating 시작합니다. 요법 이니에 대한 첫 번째 새장에서 처음으로 제목을 넣으십시오. 십오분 후, 두 번째 새장을 가장 먼저 주제를 이동합니다. Quatricide의 결핵 최초의 새장을 청소하십시오. 다음, 먼저 청소 새장에서 두번째로 제목을 넣으십시오. 후속 과목이 과정을 계속합니다. 궁극적으로, 각 과목은 사전 테스트하는 요법 이니, 또 15 분 아레나 (네번째이자 마지막 케이지)에 배치되기 전에 세 새장에서 길들여지지하여야한다.
(B) 
블라인드 연구원
- 향기 샘플 필터 종이의 2 인치 사각형으로 2 인치의 적절한 숫자를 확인합니다.
- 미리 선택된 향기를 사용하여 적절하게 그것을 희석. 이러한 땅콩 버터와 같은 소수성 시료의 경우, 용매로 석유를 사용하여, 모든 다른, 증류수를 사용합니다. 와동.
- 전체 케이지 최종 초점에 이러한 biosafety 캐비닛의 맨 끝에 디지털 비디오 녹화 장치를 설정합니다. 매개 변수가 적절한 수 있도록하기 위해 예비 비디오를 가져가라.
- dilutions가, 테스트 시련의 순서를 무작위로 돌보는 것입니다 순서를 기록합니다.
- 기록 대상의 쓰레기 및 식별 번호.
- 일단 제목은 첫 번째 재판에 대한 준비를 시작 경기장에서 15 분 동안 길들여되었습니다. 필터 종이 광장에 그것을 pipetting 전에 원뿔 관에서 처음으로 희석을 피펫 아래. 필터 종이 표면은 최적의 ~ 85 % 적용 (솔루션의 약 0.50 MLS)해야합니다. 필터 용지가 지나치게 포화되지 않는지 확인 kimwipe을 사용합니다.
- 비디오 녹화를 시작합니다.
- 동물의 현재 위치의 반대편 끝에있는 새장에서 필터 종이 사각형을 놓습니다.
- 타이밍을 시작합니다.
- 삼분 후, 녹음을 중지하고 희석 냄새를 제거합니다.
- 한 향기 (예 : 계피) 테스트되어야하는 경우, 경기장에서 첫 번째 실험 대상을 제거합니다. 반복 적절하게 각 과목에 대한 냄새를 diluting, 각 동물에 대해 6-11 단계를 반복합니다. 하나 이상의 향기가 테스트되어야하는 경우, 그러나, 무대에서 테스트 주제를 제거하지 마십시오. 대신 타이밍을 시작합니다.
- 적절하게 위에 나열된 것과 같은 방법을 사용하여 다음 냄새를 희석.
- 일분 후, 비디오 녹화를 시작합니다. 동물의 현재 positio의 반대 끝에있는 새장에있는 다음 향기의 희석과 필터 종이 스퀘어 플레이스N.
- 반복 각 시험에 대한 비디오 파일 번호를 지적, 각 향기에 대해 6-13 단계를 반복합니다.
- 반복 각 과목에 대해 6-14 단계를 반복합니다.
그림 2. 후각 감도 테스트 세션에 대한 대표적인 결과가.하거나 제어 그룹 (그룹) 또는 실험 그룹 (그룹 B)의 각각의 마우스는 계피의 다섯 가지 dilutions 한 삼분의 세션에 대해 필터를 종이에 추출 중 하나에 노출되었다. 총 시간은 거름종이가 평가되었다 탐험 보냈다. 그룹의 생쥐는 그룹 B에보다 큰 후각 감성을 가지고
후각 환경 설정 테스트
이 테스트는 즉 특정 검출 결함, 매력이나 aversive 냄새를 감지하는 능력을 식별하도록 설계되었습니다. 다음 절차는 고바의 프로토콜, K., 동부 표준시 al.3에서 후한 빌려. 다시 두 연구자는 주제 genotypes 및 / 또는 조건 한 맹인과 테스트에 참여해야합니다. 총 탐험 시간은 다시 다양한 냄새에 대한 (비디오 감상시) 기록됩니다. 물보다 총 탐험 배 이상있는 사람 냄새가 적은 물보다 시간이있는 사람은 "aversive"칭했다하는 동안 "매력"로 지정되어 있습니다. 연구자는 다음 같은 냄새가 다른 시험 과목에 대해 "매력적인"또는 "aversive"여부를 고려합니다.
기본 연구자에 대한 강한 민감도 테스트 섹션에서 1-3 단계를 따르십시오.
블라인드 연구원
후각 환경 설정 테스트를위한 절차는 2 단계와 4 약간의 수정과 동일합니다. 다음과 같이 변경과 함께 맹인 연구자에 대한 강한 민감도 테스트 섹션의 단계 1-15을 따르시기 바랍니다 : 2 단계 들어, 미리 선택된 향기를 (매력적이고 aversive 모두 향기의 조합)를 사용하여, 각 중 적절하게 희석 솔루션을 원뿔 튜브. 이러한 땅콩 버터와 같은 소수성 시료의 경우, 용매로 석유를 사용하여, 모든 다른, 증류수를 사용합니다. 와동. 4 단계의 경우, 오히려 테스트로 희석을 기록보다 시련의 순서를 randomizing, 테스트하게 될 다양한 향기의 순서를 기록합니다.
이 테스트는 즉 특정 검출 결함, 매력이나 aversive 냄새를 감지하는 능력을 식별하도록 설계되었습니다. 다음 절차는 고바 K. 외의 프로토콜에서 후한 빌려. 3. 다시 두 연구자는 주제 genotypes 및 / 또는 조건 한 맹인과 테스트에 참여해야합니다. 총 탐험 시간은 다시 다양한 냄새에 대한 (비디오 감상시) 기록됩니다. 이하 물보다 시대에 사람이 "aversive"칭했다하는 동안 물보다 총 탐험 배 이상있는 사람 냄새는 "매력"로 지정되어 있습니다. 연구자는 다음 같은 냄새가 다른 시험 과목에 대해 "매력적인"또는 "aversive"여부를 고려합니다.
기본 연구자에 대한 강한 민감도 테스트 섹션에서 1-3 단계를 따르십시오.
블라인드 연구원
후각 환경 설정 테스트를위한 절차는 2 단계, 4, 13 약간의 수정과 동일합니다. 다음과 같이 변경과 함께 맹인 연구자에 대한 강한 민감도 테스트 섹션의 단계 1-15을 따르시기 바랍니다 : 2 단계 들어, 미리 선택된 향기를 (매력적이고 aversive 모두 향기의 조합)를 사용하여, 각 중 적절하게 희석 솔루션을 원뿔 튜브. 이러한 땅콩 버터와 같은 소수성 시료의 경우, 용매로 석유를 사용하여, 모든 다른, 증류수를 사용합니다. 와동. 4 단계의 경우, 오히려 테스트로 희석을 기록보다는, 각 시험의 순서를 randomizing, 테스트하게 될 다양한 향기의 순서를 기록합니다. 단계 13의 동물의 현재 위치의 반대편 끝에있는 케이지의 다음 향기와 필터 용지 사각형을 놓습니다.
그림 3. 후각 환경 설정 테스트 세션에 대한 대표적인 결과가. 각각의 마우스는 하나, 세 분 세션에 대해 필터를 종이에 서로 다른 향기의 각에 노출되었다. 총 시간은 거름종이가 평가되었다 탐험 보냈다. 땅콩 버터와 바닐라 향기 매력입니다 (탐험 시간 향기> 탐험 시간 물)과 2 Methylbutyric 산성은 (탐험 시간 향기 <탐험 시간 물) aversive입니다.
강한 시험 점수
후각 감도와 환경 모든 동영상을 획득하면, 그것은 총 시간 각 희석 / 냄새를 탐험 지출을 분석하는 것이 필요합니다. 맹인 연구자들이 일관성에 대한 모든 동영상을 분석했습니다.
- VID 미리보기이오 다음 지적 : 마우스 필터 용지를 조사 및 D) 3 분 경과되었을 때) 거름종이가 경기장에 배치되었을 때, B) 마우스 필터 종이, C를 접근 언제 ()에서 때 필터 종이)는 경기장에 배치했다. 마우스의 행동에 초점을 때 알면 쉽게 정확 총 시간 검토한 탐험 지출 점수를 수 있습니다.
- 비디오를 검토합니다. 마우스가 처음 여과지 (지연)을 조사 시간을 기록해 둡니다.
- 모든 조사는 경기장에서 필터 용지를 삽입 후 3 분 이내에 스톱워치, 시간을 사용합니다. 조사 시간은 마우스의 나레스은 여과지에서 <1mm되는 시간으로 정의됩니다. 이것은 마우스 필터 종이 가까이에있는 시간 중 하나를 포함하지 않는 것이 중요하지만, 적극적으로 그것을 조사하지 않습니다. 전체 탐험 시간에 종이에 앉아있는 논문이나 관찰을 씹는 및 핥아의 복싱 경기를 포함시키지 마십시오. 그것은 정확하게 후각 행동을 분석하여 이러한 규칙에 밀접하고 지속적으로 준수하는 것이 필요합니다.
- 기록 지연 시간은 총 시간은 필터 종이 및 비디오 파일 번호를 조사 보냈다.
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Discussion
상기 테스트는 기본적인 후각 기능의 빠르고 안정적인 평가를 위해 수 있습니다. 그것이 신뢰성 테스트에 대한 과목의 적절한 선택과 준비가 필요하다는 그러나, 간과되지 않습니다. 아프하거나 마비 아르 동물은 종종 일관성 시험 과목입니다. 또한, 시험 과목 요법 이니,이 핵심입니다. 우리는 요법 이니 과정에서 여러 케이지의 사용은 동물 실험자들이 취급하고 환경 변화와 함께 편안하게 될 수 것으로 나타났습니다. 또한 요법 이니에 대한 지적보다 짧은 시간이 불안을 줄이기 위해 충분하지 않은 것으로 나타났습니다. 불안 동물은 종종 예측 시험 과목이며 진정한 차이점을 흐릿하게 수 있습니다.
생쥐의 실제 테스트에서, 그것은뿐만 아니라 데이터를 수집하면 일치뿐만 아니라, 주제 '행동을 분석하는 것이 중요합니다. 우리는 실험 대상의 코가 전체 탐험 시간의 일부로 여과지에서 <1mm 때 그것이 유용 해당 시간을 계산하는 것으로 확인되었습니다. 또한, 필터 종이를 물고 또는 씹는 등의 행동은 총 탐험 시간에 포함되지 않습니다. 또한, 지연 시간 (매력적인 향기에 대한)도 유용한 통계 수 있습니다. 다른 쥐 배경 제어 및 실험 그룹 사이의 효과적인 차별에 대한 향기의 다른 dilutions 필요할 수 있습니다. 또한 섹스와 일치하는 나이와 일치하는 쌍하는 것이 중요합니다. 우리는 경험적으로 순진한 생쥐의 실험 테스트하기 전에 적절한 향기의 dilutions을 (제어 그룹과 유사한 과목)에 파생하는 것이 도움이 발견했습니다. 마지막으로,이 시험은 다른인지 특히 장애, 학습 및 / 또는 메모리에 결함의 영향을 최소화하기 위해 선택되었다. 이를 위해, 그것은 테스트를 위해 순진 마우스를 사용하는 것이 중요합니다.
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Acknowledgments
기금 :이 작품은 스튜어트 HQ & 빅토리아 퀀 Predoctoral 원정대 (RMW), NIH 파이 오니아 수상 (RAS)에 의해 지원되었다
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Methylbutyric acid | Reagent | Sigma-Aldrich | W269506 | Concentrations Used:9.16 x 10-1 – 10-8 M (in H20) |
| Pure Vanilla Extract | Reagent | McCormick & Co. | n/a | Concentrations Used:10-1 – 10-5 dilution (in H20) |
| Peanut Butter (Skippy, Extra Crunchy) | Reagent | Unilever | n/a | Concentrations Used:10% (w/v), in mineral oil |
| Cinnamon Extract | Reagent | McCormick & Co. | n/a | Concentrations Used:10-1 – 10-5 dilution (in H20) |
| Mineral Oil, light | Reagent | Fisher Scientific | O121-1 | Concentrations Used:N/A |
References
- Crawley, J. N. What’s Wrong with my Mouse? Behavioral Phenotyping of Transgenic and Knockout Mice. , John Wiley and Sons. 42-60 (2007).
- Irwin, S. Comprehensive observational assessment: Ia. A systematic, quantitative procedure for assessing the behavioral and physiologic state of the mouse. Psychopharmacologia. 13, 222-257 (1968).
- Kobayakawa, K. Innate versus learned odour processing in the mouse olfactory bulb. Nature. 450, 503-508 (2007).
