طريقة لتلطيخ جسم الجامع في جبل الفرخ
Summary
هذا الفيديو يوضح كل جبل المناعية ، وهي الطريقة التي نمط التعبير المكاني والزماني للمستضد يمكن تصور افراخ الدجاج في الشباب. وقدم أصلا من قبل هذه الطريقة ودود جين Jessell توم.
Abstract
الجنين الفرخ هو أداة قيمة في دراسة التطور الجنيني المبكر. شفافيته ، وسهولة الوصول وسهولة التلاعب ، وجعلها أداة مثالية لدراسة التعبير الأضداد في تطوير الدماغ ، والأنبوب العصبي والجسيدة. هذا الفيديو يوضح الخطوات المختلفة في تلطيخ الأضداد كلها يشن باستخدام الأجسام المضادة الثانوية HRP مترافق ؛ أولا ، يتم تشريح الجنين من بويضة والثابتة في بارافورمالدهيد. الثاني ، هو البيروكسيداز الذاتية المعطل ، ثم يتعرض الجنين إلى جسم الابتدائي. يغسل بعد عدة ، وحضنت الجنين مع الأجسام المضادة الثانوية مترافق لHRP. وكشف النشاط البيروكسيداز باستخدام التفاعل مع الركيزة diaminobenzidine. أخيرا ، يتم إصلاح الجنين ومعالجتها للتصوير الفوتوغرافي وsectioning. ميزة هذه الطريقة على استخدام الاجسام المضادة فلوري هو أنه يمكن معالجة الأجنة لsectioning الشمع ، مما يتيح للدراسة المواقع مستضد في المقطع العرضي. وقدم أصلا من قبل هذا الأسلوب دود جين وتوم Jessell<sup> 1</sup>.
Protocol
Discussion
هذا الفيديو يوضح الخطوات المختلفة في أداء كامل للأجسام المضادة في جبل تلطيخ افراخ الدجاج الشباب. ويستخدم هذا البروتوكول أساسا لتوصيف المكاني والزماني للرواية في الأضداد 2،3 الفرخ ، فضلا عن استخدام علامات مستضدي المعروفة لتحديد التشوهات الجنينية التالية اهانة…
Acknowledgements
تم الحصول على أجسام مضادة وحيدة النسيلة (15.3B9 ، PAX7) التي طورتها (دود ، TM Jessell وكواكامي ألف) من البنك التنموي ورم هجين الدراسات المتقدمة تحت رعاية معاهد الصحة القومية والحفاظ عليها من جامعة أيوا ، قسم العلوم البيولوجية ، ولاية ايوا. موانئ دبي هي المستفيدة من جائزة روث 1F32 – 01A1 كيرشتاين DA021977 من المعهد الوطني لتعاطي المخدرات. وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة مارغريت Alkek M. إلى RHF.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Eggs | Charles River Laboratories | Premium Fertile | Fertilized, HH4 (16 hr) | |
| Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 or similar | |
| Marsh Automatic Incubator | 기타 | Lyon | RX | |
| Curved Forceps (1) | Tool | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Forceps (2) | Tool | Fine Science Tools | 11002-13 | |
| Fine scissors | Tool | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Plastic dishes | Tool | Falcon | 353001 | |
| Rubber Bulb | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70980 | |
| Pasteur Capillary Pipette | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | round edge under flame |
| Microdissecting knife | Tool | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to cut embryo from surrounding membranes following fixation |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Reagent | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
| 16% PFA | Reagent | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 30% H2O2 | Reagent | Sigma | H1009 | |
| BSA | Reagent | Sigma | A3803 | |
| NGS | Reagent | Jackson Immuno | 005-000-121 | |
| Primary Antibodies | Reagent | Developmental studies Hybridoma Bank | 4G11, 15.3B9, PAX7 | For these antibodies, investgators used mouse donnors |
| Peroxidase conjugated-Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Reagent | Jackson Immuno | 115-035-003 | |
| 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride | Reagent | Pierce | 34001 | Store at -20; Allow bottle to warm to RT before use. |
| Cedar wood oil | Reagent | Sigma | W522503 | |
| Fast green FCF | Reagent | Sigma | F7252 | |
| Minuten pins 0.2mm diam | Fine Science Tools | 26002-20 |
References
- Yamada, T., Placzek, M., Tanaka, H., Dodd, J., Jessell, T. M. Control of cell pattern in the developing nervous system: Polarizing activity of the floor plate and notochord. Cell. 64, 635-647 (1991).
- Streit, A., Stern, C. D., Thery, C., Ireland, G. W., Aparicio, S., Sharpe, M. J., Gherardi, E. A role for HGF/SF in neural induction and its expression in Hensen’s node during gastrulation. Development. 121, 813-824 (1995).
- Basch, M., Bronner-Fraser, M., Garcia-Castro, M. Specification of neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7. Nature. 441, 218-222 (2006).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen’s node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
