Deze video toont ganse berg immunohistochemie, een methode waarmee de ruimtelijke en temporele expressiepatroon van een antigeen kan worden gevisualiseerd in jonge kippenembryo's. Deze methode werd oorspronkelijk geïntroduceerd door Jane Dodd en Tom Jessell.
Abstract
Het kuiken embryo is een waardevol instrument in de studie van de vroege embryonale ontwikkeling. De transparantie, toegankelijkheid en het gemak van manipulatie, maken het een ideale tool voor het bestuderen antilichaam uitdrukking in de ontwikkeling van de hersenen, neurale buis en somiet. Deze video toont de verschillende stappen in zijn geheel-mount antilichaam kleuring met behulp van HRP geconjugeerde secundaire antilichamen, de eerste plaats, het embryo wordt ontleed door het ei en gefixeerd in paraformaldehyde. Ten tweede, endogene peroxidase wordt geïnactiveerd; Het embryo wordt vervolgens blootgesteld aan primaire antilichaam. Na een aantal wasbeurten, is het embryo geïncubeerd met secundair antilichaam geconjugeerd aan HRP. Peroxidase-activiteit wordt onthuld met behulp van reactie met diaminobenzidine substraat. Tot slot wordt het embryo vast en verwerkt voor fotografie en snijden. Het voordeel van deze methode boven het gebruik van fluorescerende antilichamen is dat embryo's kunnen worden verwerkt voor het snijden was, waardoor de studie van antigeen sites in doorsnede. Deze methode werd oorspronkelijk geïntroduceerd door Jane Dodd en Tom Jessell<sup> 1</sup>.
Protocol
I. Schematisch overzicht: Deze video toont de verschillende stappen in het ganse berg immunohistochemie in kippenembryo. Eerst wordt het embryo vastgesteld in PFA [IHC1]. Vervolgens wordt de endogene peroxidase activiteit uitgeblust [IHC2]. Het embryo wordt vervolgens geïncubeerd in primaire antilichaam [IHC3]. Na een aantal wasbeurten, het embryo wordt geïncubeerd in secundaire antilichaam [IHC4]; Kleur reactie wordt geopenbaard via DAB [IHC5] en antilichaam vlekken lijkt oranje [IHC6]. </p…
Discussion
Deze video toont de verschillende stappen bij het uitvoeren van whole-mount antilichaam kleuring in jonge kippenembryo's. Dit protocol wordt hoofdzakelijk gebruikt voor de ruimtelijke en temporele karakterisering van nieuwe antilichamen in kuiken 2,3, evenals voor het gebruik van bekende antigene markers om embryonale misvormingen na belediging 4 vast te stellen.
Acknowledgements
De monoklonale antilichamen (15.3B9, PAX7) ontwikkeld door (J. Dodd, TM Jessell en A. Kawakami) werden verkregen uit de Developmental Studies Hybridoma Bank ontwikkeld onder auspiciën van de NICHD en onderhouden door de Universiteit van Iowa, Afdeling Biologische Wetenschappen , Iowa. DP is ontvanger van Ruth Kirschstein Award 1F32-01A1 DA021977 van het National Institute on Drug Abuse. Dit werk werd ondersteund door de Margaret M. Alkek Stichting RHF.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Eggs
Charles River Laboratories
Premium Fertile
Fertilized, HH4 (16 hr)
Stereomicroscope
Microscope
Leica Microsystems
MZ9.5 or similar
Marsh Automatic Incubator
기타
Lyon
RX
Curved Forceps (1)
Tool
Electron Microscopy Sciences
72991-4C
Forceps (2)
Tool
Fine Science Tools
11002-13
Fine scissors
Tool
Fine Science Tools
14161-10
Plastic dishes
Tool
Falcon
353001
Rubber Bulb
Tool
Electron Microscopy Sciences
70980
Pasteur Capillary Pipette
Tool
Electron Microscopy Sciences
70950-12
round edge under flame
Microdissecting knife
Tool
Fine Science Tools
10056-12
Use to cut embryo from surrounding membranes following fixation
Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base
Reagent
Dow Corning
0001986475
Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C
16% PFA
Reagent
Electron Microscopy Sciences
15710
30% H2O2
Reagent
Sigma
H1009
BSA
Reagent
Sigma
A3803
NGS
Reagent
Jackson Immuno
005-000-121
Primary Antibodies
Reagent
Developmental studies Hybridoma Bank
4G11, 15.3B9, PAX7
For these antibodies, investgators used mouse donnors
Peroxidase conjugated-Goat Anti-Mouse IgG (H+L)
Reagent
Jackson Immuno
115-035-003
3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride
Reagent
Pierce
34001
Store at -20; Allow bottle to warm to RT before use.