Cette vidéo montre tout le mont immunohistochimie, une méthode par laquelle le profil d'expression spatiale et temporelle d'un antigène peut être visualisé dans des embryons de poulet jeunes. Cette méthode a été initialement présenté par Jane et Tom Dodd Jessell.
Abstract
L'embryon de poulet est un outil précieux dans l'étude du développement embryonnaire précoce. Sa transparence, l'accessibilité et la facilité de manipulation, en font un outil idéal pour étudier l'expression d'anticorps dans le développement du cerveau, du tube neural et des somites. Cette vidéo montre les différentes étapes de coloration des anticorps entiers de montage en utilisant HRP conjugué anticorps secondaire; d'abord, l'embryon est disséquée de l'oeuf et fixés dans du paraformaldéhyde. Deuxièmement, la peroxydase endogène est inactivé; L'embryon est ensuite exposée à l'anticorps primaire. Après plusieurs lavages, l'embryon est incubée avec un anticorps secondaire conjugué à la HRP. L'activité peroxydase est révélée en utilisant la réaction avec le substrat diaminobenzidine. Enfin, l'embryon est fixe et traitées pour la photographie et de sectionnement. L'avantage de cette méthode sur l'utilisation d'anticorps fluorescents est que les embryons peuvent être traités pour la coupe de la cire, permettant ainsi à l'étude de sites antigéniques en coupe transversale. Cette méthode a été initialement présenté par Jane et Tom Dodd Jessell<sup> 1</sup>.
Protocol
I. Schéma Aperçu: Cette vidéo montre les différentes étapes de l'immunohistochimie monter ensemble dans l'embryon de poulet. Tout d'abord, l'embryon est fixé en PFA [IHC1]. Ensuite, l'activité peroxydase endogène est éteint [IHC2]. L'embryon est ensuite incubée dans l'anticorps primaire [IHC3]. Après plusieurs lavages, l'embryon est incubé dans anticorps secondaire [IHC4]; réaction colorée se révèle en DAB [IHC5] et la coloration des anticorps ap…
Discussion
Cette vidéo montre les différentes étapes dans l'exécution de coloration des anticorps entiers monter dans des embryons de poulet jeunes. Ce protocole est essentiellement utilisé pour la caractérisation spatiale et temporelle de nouveaux anticorps chez le poulet 2,3, ainsi que pour l'utilisation de marqueurs antigéniques connues pour déterminer les malformations embryonnaires suivantes insulte 4.
Acknowledgements
Les anticorps monoclonaux (15.3B9, PAX7) développé par (J. Dodd, MC Jessell et A. Kawakami) ont été obtenus auprès de la Banque de développement d'hybridomes études élaborées sous les auspices de l'NICHD et maintenu par l'Université de l'Iowa, Département des sciences biologiques , dans l'Iowa. DP est récipiendaire du Prix Ruth Kirschstein 1F32-01A1 DA021977 du National Institute on Drug Abuse. Ce travail a été soutenu par la Fondation Margaret M. Alkek au RHF.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Eggs
Charles River Laboratories
Premium Fertile
Fertilized, HH4 (16 hr)
Stereomicroscope
Microscope
Leica Microsystems
MZ9.5 or similar
Marsh Automatic Incubator
기타
Lyon
RX
Curved Forceps (1)
Tool
Electron Microscopy Sciences
72991-4C
Forceps (2)
Tool
Fine Science Tools
11002-13
Fine scissors
Tool
Fine Science Tools
14161-10
Plastic dishes
Tool
Falcon
353001
Rubber Bulb
Tool
Electron Microscopy Sciences
70980
Pasteur Capillary Pipette
Tool
Electron Microscopy Sciences
70950-12
round edge under flame
Microdissecting knife
Tool
Fine Science Tools
10056-12
Use to cut embryo from surrounding membranes following fixation
Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base
Reagent
Dow Corning
0001986475
Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C
16% PFA
Reagent
Electron Microscopy Sciences
15710
30% H2O2
Reagent
Sigma
H1009
BSA
Reagent
Sigma
A3803
NGS
Reagent
Jackson Immuno
005-000-121
Primary Antibodies
Reagent
Developmental studies Hybridoma Bank
4G11, 15.3B9, PAX7
For these antibodies, investgators used mouse donnors
Peroxidase conjugated-Goat Anti-Mouse IgG (H+L)
Reagent
Jackson Immuno
115-035-003
3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride
Reagent
Pierce
34001
Store at -20; Allow bottle to warm to RT before use.