Dieses Video zeigt whole mount Immunhistochemie, eine Methode, durch die die räumliche und zeitliche Expressionsmuster eines Antigens visualisiert werden bei jungen Hühnerembryonen kann. Diese Methode wurde ursprünglich von Jane Dodd und Tom Jessell eingeführt.
Abstract
Der Hühnerembryo ist ein wertvolles Werkzeug in der Studie der frühen Embryonalentwicklung. Seine Transparenz, Zugänglichkeit und einfache Handhabung machen ihn zu einem idealen Werkzeug zur Untersuchung der Antikörper-Expression im sich entwickelnden Gehirn, Neuralrohr und Somiten. Dieses Video zeigt die verschiedenen Schritte ganz-mount Antikörper-Färbung mit HRP konjugierte Sekundärantikörper; Erste, der Embryo aus dem Ei präpariert und fixiert in Paraformaldehyd. Zweitens endogene Peroxidase inaktiviert wird; Der Embryo wird dann in primärer Antikörper ausgesetzt. Nach mehrmaligem Waschen wird der Embryo mit sekundärem Antikörper, konjugiert mit HRP inkubiert. Peroxidase-Aktivität zeigte mit Reaktion mit Diaminobenzidin Substrat. Schließlich ist der Embryo fixiert und für die Fotografie und Schneiden. Der Vorteil dieser Methode gegenüber der Verwendung von fluoreszierenden Antikörpern ist, dass Embryonen für Wachs Schnitte verarbeitet werden, so dass die Untersuchung von Antigen-Sites im Querschnitt. Diese Methode wurde ursprünglich von Jane Dodd und Tom Jessell eingeführt<sup> 1</sup>.
Protocol
I. Schematische Übersicht: Dieses Video zeigt die verschiedenen Schritte in whole mount Immunhistochemie in Hühnerembryo. Zunächst wird der Embryo in PFA fixiert [IHC1]. Dann wird die endogene Peroxidase Aktivität abgeschreckt [IHC2]. Der Embryo wird dann in Primärantikörper [IHC3] inkubiert. Nach mehrmaligem Waschen wird der Embryo in sekundärem Antikörper [IHC4]; Farbreaktion zeigte mit DAB [IHC5] und Antikörper-Färbung erscheint orange [IHC6]. <img src=…
Discussion
Dieses Video zeigt die verschiedenen Schritte bei der Durchführung ganz-mount Antikörper-Färbung bei jungen Hühnerembryonen. Dieses Protokoll ist im Wesentlichen für die räumliche und zeitliche Charakterisierung neuartiger Antikörper in chick 2,3 verwendet, sowie für die Verwendung bekannter antigener Marker zu embryonalen Missbildungen folgenden Beleidigung 4 zu bestimmen.
Acknowledgements
Die monoklonalen Antikörper (15.3B9, PAX7) durch (J. Dodd, TM Jessell und A. Kawakami) entwickelt wurden, aus dem Developmental Studies Hybridoma Bank unter der Schirmherrschaft der NICHD und von der University of Iowa gepflegt, Department of Biological Sciences entwickelt erhalten , Iowa. DP ist Empfänger von Ruth Kirschstein-Award 1F32 DA021977-01A1 aus dem National Institute on Drug Abuse. Diese Arbeit wurde von der Margaret M. Alkek Stiftung RHF unterstützt.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Eggs
Charles River Laboratories
Premium Fertile
Fertilized, HH4 (16 hr)
Stereomicroscope
Microscope
Leica Microsystems
MZ9.5 or similar
Marsh Automatic Incubator
기타
Lyon
RX
Curved Forceps (1)
Tool
Electron Microscopy Sciences
72991-4C
Forceps (2)
Tool
Fine Science Tools
11002-13
Fine scissors
Tool
Fine Science Tools
14161-10
Plastic dishes
Tool
Falcon
353001
Rubber Bulb
Tool
Electron Microscopy Sciences
70980
Pasteur Capillary Pipette
Tool
Electron Microscopy Sciences
70950-12
round edge under flame
Microdissecting knife
Tool
Fine Science Tools
10056-12
Use to cut embryo from surrounding membranes following fixation
Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base
Reagent
Dow Corning
0001986475
Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C
16% PFA
Reagent
Electron Microscopy Sciences
15710
30% H2O2
Reagent
Sigma
H1009
BSA
Reagent
Sigma
A3803
NGS
Reagent
Jackson Immuno
005-000-121
Primary Antibodies
Reagent
Developmental studies Hybridoma Bank
4G11, 15.3B9, PAX7
For these antibodies, investgators used mouse donnors
Peroxidase conjugated-Goat Anti-Mouse IgG (H+L)
Reagent
Jackson Immuno
115-035-003
3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride
Reagent
Pierce
34001
Store at -20; Allow bottle to warm to RT before use.